[发明专利]一种母猪繁殖障碍病原检测引物、试剂盒、病原检测方法和应用

说明书

本发明属于动物病原分子诊断技术领域，具体是涉及到一种母猪繁殖障碍病原检测引物、试剂盒、病原检测方法和应用，包括检测猪常见繁殖障碍类病原PRRSV、PRV、CSFV、PCV2的4对引物和探针，本发明通过荧光pcr反应体系同时检测四种病原菌，操作简单，灵敏度好，准确度高，效率更高。

技术领域

本发明属于动物病原分子诊断技术领域，具体是涉及到一种母猪繁殖障碍病原检测引物、试剂盒、病原检测方法和应用。

背景技术

繁殖障碍是生猪养殖中经常遇到的问题，也是母猪的主要常见疫病，其临床症状主要表现为不孕、流产、胚胎早期死亡、死产、木乃伊、畸形、弱仔和少仔等。母猪繁殖障碍病因多而复杂，可分为传染性因素和非传染性因素两大类。在传染性因素中有病毒、细菌和寄生虫等。

病毒是临床上引起母猪繁殖障碍最为常见的因素，此类病毒主要包括：猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、乙型脑炎病毒(JEV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、圆环病毒2型(PCV2)。

早期正确诊断是预防和控制繁殖障碍疾病的关键。当前母猪繁殖障碍性疾病的流行和发病特点是多因素的，混合感染和继发感染普遍存在，很难找到单一病原，因此，一般通过流行病学特点、临床症状、剖检等常规手段分析，很难做出精准的诊断，需要结合实验室检测结果进行最后病因的确诊。

常见病毒的实验室检测方法包括有分离培养、电镜形态检查、血清抗体检测、病毒抗原和核酸检测等。病毒分离方法是公认的“金标准”，但病毒培养养周期较长、流程繁琐，不利于疫病早期诊断。血清抗体检测，如酶联免疫吸附试验ELISA、免疫荧光试验IFA、中和试验SN、乳胶凝集试验LA等，因空窗期的存在，更多适用于回顾性检测，而非早期诊断。病毒核酸分子检测，如PCR、核酸芯片和荧光定量PCR等，具有高度的特异性和敏感性，已成为最常用的实验室诊断技术。

现有技术的缺点/不足：

1、病原分离培养难度大、耗时长。

2、血清学检测技术因抗原或抗体交叉，极易出现假阳性或假阴性结果。

3、常规PCR操作复杂操作时间长，易污染，技术操作要求高，质量控制不易，难以标准化。

4、核酸芯片技术研发和使用复杂，很难在临床应用中推广。

5、荧光PCR技术，相比较核酸芯片技术，具有更高的灵敏度和特异性，但目前多以单检技术为主，一次只能检测一种或一类病原，在高通量检测应用上还有提升空间。

现有技术存在以上不足的原因，是因为：

1、病毒体外培养需要对细胞有较好的适应性，很多时候需要对细胞株进行筛选和驯化，会花费大量的时间和投入，因此更多的用于已知病毒的分离和后续基础研究等，而非早期诊断。

2、血清学检测，依赖于抗原和抗体质量，而抗原和抗体需要通过生物体进行体内合成，存在较大的交叉干扰因素，而且现有技术的灵敏度也普遍低于核酸分子检测方法。

3、核酸芯片技术研发成本高，使用需要借助昂贵的大型仪器和电脑数据库综合分析，只适用于大型科研院所机构，很难在临床应用中推广。

4、目前市场上大量的技术和产品是针对某种或某类病原的单检产品。多重PCR或联检荧光定量PCR，特别是后者，因涉及到多对引物、探针组合之间的结构影响，极易对各标的检测造成负面影响，从而导致检测灵敏度下降和检测结果的不准确。因此联检荧光定量PCR技术不是简单的将单检技术糅合，开发难度要大的多。

5、病毒本身变异快、基因型和血清型多等因素，造成引物探针设计上具有较大的难度，特别是在联检技术上，考虑到上述序列间的结构影响，可供选择的位点会少的多，较难以找到合适的引物。