[发明专利]基于固态纳米孔检测超低浓度分子标志物的方法及装置

说明书

本发明属于DNA测序技术领域，公开了一种基于固态纳米孔技术检测超低浓度分子标志物的方法。该方法主要利用纳米孔两侧的盐浓度梯度来实现低浓度DNA、RNA分子的检测，具有高通量、周期短、信噪比较高、精度较高的优点，对疾病的早期检测和治疗具有重大的意义。同时，本发明还公开了一种SiNx薄膜固态纳米孔反应装置，该装置能够克服生物分子纳米孔的不稳定性和孔径不易控制性，还能改善了传统纳米孔检测装置信噪比低、易受外界环境干扰等问题。

技术领域

本发明属于DNA测序技术，具体涉及一种SiNx薄膜固态纳米孔技术检测飞摩尔量级浓度分子标志物的方法及装置。

背景技术

DNA测序技术作为人类探索生命秘密的重要手段之一，其技术水平不断发展，成为生命科学研究的核心领域，对生物、化学、电学、生命科学、医学等领域的技术发展起到巨大的推动作用。DNA测序技术自诞生以来经历了几代变革。

第一代技术使用的是1977年Sanger等人发明的经典双脱氧核苷酸末端终止测序法，以及Gilbert等人提出的类似的化学降解法。第二代技术作为目前市场上主流的DNA测序技术,较第一代测序技术而言,测量通量明显提高。如Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLID技术。第三代技术以Pacific Biosciences公司的RS系统为代表,以单分子实时测序为主要特点,对单个荧光分子进行高灵敏度检测,从而快速获得DNA序列信息。纳米孔测序技术是第四代测序技术,用于DNA测序的纳米孔有两类：生物纳米孔(α-溶血素)和固态纳米孔(包括各种硅基材料、SiNx、碳纳米管、石墨烯、玻璃纳米管等)。相比于生物纳米孔,固态纳米孔在稳定性、电流噪声、工艺集成方面有着显著的优势。

然而，基于纳米孔的DNA测序方法从1996年被提出至今，越来越多的研究小组投入到这项研究，但该技术发展至今仍没有达到预期的检测目标。这主要是由于纳米通道的尺寸限制效应和边界层问题的复杂性，使得建立描述以DNA聚合物链为对象的聚合物纳流体动力学的数学模型非常困难，生物分子在纳通道内运动规律很难建立，因此要利用纳米孔技术对DNA进行测序，真正实现商业化应用还面临着严峻的挑战，需要科学家进一步探索，如提高通道的选择性和灵敏度、控制DNA穿越速度及提高信噪比等。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于固态纳米孔并利用其两侧的盐浓度梯度，实现检测超低浓度DNA、RNA分子的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于固态纳米孔检测超低浓度分子标志物的方法，该方法使用了一种SiNx薄膜固态纳米孔反应装置，该装置主要由7个部分组成，分别是样品池(1)，SiNx薄膜基片(4)，SiNx薄膜将样品池分隔为顺式腔(2)和反式腔(3)，SiNx薄膜上有电击击穿的纳米孔(5)，连接顺式腔和反式腔的电极(6)和外接电源(7)。检测目标分子标志物时前，先用多级电流脉冲击穿法在SiNx薄膜上制备出纳米孔(5)，随后在纳米孔两侧的顺式腔(2)和反式腔(3)中形成盐浓度梯度，最后在样品池(1)两端施加电压驱使待测分子过孔从而产生离子阻塞电流脉冲信号，最后将采集到的信号进行分析以检索出目标分子。

进一步，SiNx薄膜在使用时先置于无水乙醇中浸泡10-15min对其窗口表面进行亲疏水性的处理，然后取出并将其放入去离子水中浸泡1-2分钟洗去表面无水乙醇，最后将其组装入样品池中备用。

进一步，样品池的两腔内先分别注入无水乙醇以达到去除腔室气泡的目的，然后用去离子水清洗三次，再注入由LiCl、Tris和EDTA混合液组成电解液。

进一步，LiCl、Tris和EDTA的比例为1M：10mM：1mM。