[发明专利]一种基于数字PCR平台POLE基因突变的检测方法

说明书

本发明公开了一种基于数字PCR平台POLE基因突变的检测方法。这一方法是基于ABI QuantStudio™3D数字PCR系统对POLE基因的F367S位点进行突变检测，利用MGB探针特异性的区分野生型和突变型的样本，能够同时在低丰度和低灵敏度的样本中得到很好的检测结果，实验可重复性能好，误差小，是检测低丰度地突变比例的优势技术。

技术领域

本发明涉及生物检测方法技术领域，具体涉及一种基于数字PCR平台POLE基因突变的检测方法。

背景技术

自从PCR技术在20世纪80年代被发明以来，这一方法已经成为生命科学研究领域中最基础和最常规的实验方法之一。第一代传统的PCR技术采用琼脂糖凝胶电泳的方法来对PCR产物进行分析，但这一方法主要适用于定性和半定量研究。在2()世纪9()年代初出现了第二代的定量PCR(quantitative PCR，qPCR)技术，通过在反应方法中加入荧光染料，检测反应中发出的荧光信号达到阈值的循环数即循环阈值(cycle threshold，Ct)来计算目的酸序列的含量。qPCR技术因其快速、简易和经济的特点，目前仍被各实验室广泛地使用。但qPCR技术所谓的“定量”仍然是相对的，依赖于Ct值和标准曲线。qPCR在目的序列含量低、表达量差异十分微小、反应方法中含大量背景序列或抑制物等情况下，灵敏度和精确度都受到很大限制。在这种背景下，第三代PCR——数字PCR(digitalPCR，dPCR)应运而生了。数字PCR的原理为dPCR把反应方法均匀分配到大量反应单元中，每个反应单元中不包含或包含一个到多个目的核酸序列，目的核酸序列的数量符合泊松分布。然后在每个反应单元中独立地进行PCR扩增。扩增结束后，检测每个反应单元的荧光信号，最终根据泊松分布和荧光信号阳性的反应单元占所有反应单元的比例来计算目的核酸序列的拷贝数。在dPCR反应中荧光信号的产生过程基本与qPCR相同。dPCR技术qPCR技术有着以下的优势：(1)高灵敏度。dPCR本质上将一个传统的PCR反应变成了数万个PCR反应，在这数万个反应单元中分别独立检测目的序列，从而大大提高了检测的灵敏度。(2)高精确度。dPCR通过计算在数万个反应单元中阳性反应单元数量和比例，可以精确地检测出变化很小的目的序列差异。(3)高耐受性。dPCR技术第一步反应方法分配的过程，可以使背景序列和PCR反应抑制物被均匀分配到每个反应单元，而大部分反应单元中并不含有目的序列，低丰度的目的序列被相对富集于某些反应单元中，从而显著地降低了这些反应单元中背景序列和抑制物对反应的干扰。另外，dPCR在对每个反应单元进行结果判读时仅判断阳性/阴性两种状态，不依赖于Ct值，受扩增效率的影响大为降低，对背景序列和抑制物的耐受能力也大大提高。(4)绝对定量。PCR直接计算目的序列的拷贝数，无需依赖于ct值和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测。

人类基因组中至少有l5种DNA聚合酶，共同参与基因组的复制与修复。根据基因的同源性，DNA聚合酶可分为7个家族，分别为：A、B、C、D、X、Y和RT家族。DNA聚合酶e(DNApolymerase epsilon，polr)与pola、po18、pol同属于DNA聚合酶B家族。DNA聚合酶￡的催化亚基fcatalytic subunit ofDNA polymerase epsilon，POLE)是polr的核心，具有两种催化活性，一是以DNA为模板的聚合酶活性，负责DNA新链的复制延长；二是核酸外切酶区的校正活性，负责对错配碱基进行识别和修复。其中，校正活性的结构称为POLE的核酸外切酶区，具有3’核酸外切酶活性，能够及时识别并切除复制过程中产生的错误碱基。编码P0LE核酸外切酶区的基因突变将导致校正功能缺失，导致突变的基因在细胞中大量累积。近年来在子宫内膜样癌、结肠癌等多种肿瘤中检测出POLE.EDMs，表现出独特的分子表型，预后较好，因此检测OLE核酸外切酶区是否存在突变有望成为判断肿瘤预后的有用指标。POLE核酸外切酶区负责细胞复制的校正功能，其突变将引起校正功能缺失，细胞内错误突变大量累积，影响肿瘤发生发展。POLE核酸外切酶区突变的肿瘤患者具有发病年龄轻、预后好的特点，有望成为判断预后的新指标。但是现在对于POLE突变肿瘤的形态学以及免疫组化表达率的研究相对较少，今后可作为研究的新方向，为临床诊断POLE突变型肿瘤提供更多诊断依据。