[发明专利]一种研究化疗急性期肿瘤细胞耐药基因表达的新方法

说明书

本发明涉及肿瘤细胞在化疗药物作用急性期耐药相关基因表达研究的新方法。所述新方法能在化疗药物作用肿瘤细胞的急性期，动态捕获肿瘤细胞集群中含量少、具有肿瘤干细胞特性的耐药细胞群。进一步利用基因表达谱分析技术或新一代高通量测序技术研究肿瘤细胞内部与耐药相关基因表达水平变化、是深度解析肿瘤细胞基因组中耐药相关基因的复杂性和肿瘤的异质性的有效手段。

技术领域

本发明属于医学分子生物学领域，涉及肿瘤细胞在化疗药物作用急性期耐药相关基因表达研究的新方法。

背景技术

在肿瘤的发展过程中，肿瘤细胞生长不受控，基因组动态改变^[1]，通过侵入附近组织并转移至远处组织损坏正常细胞。采用化疗手段，不仅可以诱导肿瘤细胞的凋亡，还能对细胞周期的改变产生明显的影响。多种化疗药物可以引起肿瘤细胞特定靶成分的损伤或功能丧失，从而传递信号引起细胞周期阻滞及进入细胞凋亡^{[2, 3]}。药物诱导细胞凋亡及细胞周期阻滞的程度可作为肿瘤化疗疗效的指标。但目前多数抗肿瘤药物进入人体内，分布广泛且缺少对肿瘤组织的选择性，大量患者在接受化疗后，肿瘤细胞对药物产生耐药性导致病情复发，大大限制了化疗药物的疗效。肿瘤细胞的耐药机制十分复杂，了解肿瘤耐药机制有助于增强药物治疗效果，提高肿瘤患者的生存率。因此，研究肿瘤耐药机制以及防止或逆转肿瘤药耐药的发生对于提高肿瘤化疗效果十分重要。

肿瘤异质性是指同一种恶性肿瘤在不同患者个体间或者同一患者体内不同部位肿瘤细胞间从基因型到表型上存在的差异。异质性的存在是肿瘤需要开展个性化治疗的主要原因，也是今后精准医学的发展方向，国际肿瘤基因组计划获得的大规模测序分析结果已进一步明确肿瘤个体间及肿瘤组织内的不同细胞间都存在广泛的异质性，这些异质性导致了肿瘤耐药性和治疗的失败^[4-8]。目前能够解释肿瘤异质性的产生机制的肿瘤干细胞学说认为：肿瘤是由一小群具有无限自我更新能力的干细胞样细胞及其产生的分化程度不均的细胞团组成，这群干细胞样的细胞被称为肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs），当某一特定肿瘤中的肿瘤干细胞向肿瘤细胞分化时会产生肿瘤异质性。此外，极个别能促进癌症形成的肿瘤干细胞很难被杀死，这可以解释为什么大部分肿瘤常常在接受治疗得到缓解后仍然会复发^[9-11]。由于肿瘤干细胞本身具有的多分化潜能、处于相对静止状态，以及CSCs在肿瘤组织中只保持比较低的比例（0.1-10%）等特性，目前尚无肿瘤干细胞建株的报道，因此，极大的限制了对肿瘤干细胞的深入研究。

近年来，随着肿瘤基因组学的快速发展，科学家可以深入挖掘肿瘤基因组水平上存在的变异，筛选出与肿瘤发病密切相关的致病突变靶点，通过设计特定的靶向药物，从而对不同肿瘤个体的分子分型及危险因素制定相应的个体化治疗方案。通过基因芯片等技术的以往检测发现，细胞系在分子水平上和它们来源的组织是相似的，所以癌症细胞系的基因表达谱和基因组差异可以代表它们所作为模型的肿瘤的表达谱和基因组差异。癌细胞系相对于固体的肿瘤来说，细胞系对细胞毒性的抗肿瘤药物更加敏感^[12]。本研究利用肿瘤干细胞本身具有的多分化潜能、耐药性、以及在肿瘤中只保持较低的含量等特性，开发了一种在化疗药物作用急性期研究肿瘤细胞耐药相关基因表达的新方法：肿瘤细胞在常规化疗药物，特定浓度作用的急性期，当肿瘤细胞在药物作用下存活率降至10%左右，此时肿瘤细胞群中大部分不耐药细胞基本死亡，存活的细胞接近肿瘤干细胞在肿瘤细胞集群中所占的比例，选择在此时间点停止药物处理，将存活细胞用正常培养液恢复培养48小时。本方法在化疗药物作用肿瘤细胞的急性期，动态捕获肿瘤细胞集群中含量少、具有肿瘤干细胞特性的耐药细胞群，然后利用基因表达谱分析技术或新一代高通量测序技术研究肿瘤细胞内部与耐药相关基因表达水平变化、深度解析肿瘤细胞基因组中耐药相关基因的复杂性和肿瘤的异质性，为研发潜在的肿瘤靶向治疗药物提供技术支持。

发明内容

本发明提供一种研究肿瘤细胞在化疗药物作用急性期耐药相关基因表达的新方法。