[发明专利]基于CRISPR/Cas9系统高通量构建棉花突变体库的方法

说明书

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及基于CRISPR/Cas9系统高通量构建棉花突变体库的方法。本发明构建了一个陆地棉的转化载体，利用这个载体在陆地棉基因组中进行高通量编辑的应用。本发明通过带有接头的引物克隆得到tRNA和CcdB基因片段，将这些基因片段连接至适用于陆地棉基因组编辑的pRGEB32‑GhU6.7‑NPTⅡ转化载体中成为一种可以高通量编辑棉花基因组的载体Htkt。本发明利用高通量转化载体的特点，可大批量设计陆地棉靶标片段并进行混合构建载体最终得到棉花突变体库。高通量测序结果表明，这种高通量载体的sgRNA覆盖率高达97％。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及基于CRISPR/Cas9系统高通量构建棉花突变体库的方法构建得到陆地棉的一个高通量转化载体，利用这个载体可以在陆地棉基因组中进行高通量编辑的应用。

背景技术

基因突变是研究基因功能的常用方法之一，从EMS突变，辐射诱变，T-DNA插入，转座子插入等随机突变方法，到锌指核酸酶(ZFN)与类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)目标基因定点修饰技术，是生物技术领域的一次突破。CRISPR是指一段具有成簇的规律间隔的短回文重复序列，通过CRISPR系统将目标序列切断后，生物个体会启动自身的修复机制，包括非同源重组修复和同源重组修复，在修复后产生插入、缺失等突变，导致目标基因功能沉默。CRISPR/Cas9基因组编辑技术通过guide RNA的介导和Cas9蛋白的切割来实现对靶基因的定点编辑，CRISPR系统可以靶向任何含5’-N20-NGG-3’(N＝A，T，G，C)或5’-CCN-N20-3’的DNA序列，其中NGG为Cas9识别所需的PAM，并且在PAM前3bp左右的位置精确的切割靶DNA双链。该技术非常简便、高效，因此成为一种强大的遗传筛选工具。利用功能缺失型或者功能获得型策略高通量筛选功能基因，是研究者快速找到调控特定表型的重要基因或关键基因的主要方法。在各种细胞系、小鼠等模式动物及模式植物水稻中，大规模运用该方法筛选功能基因已经取得了巨大成功。

2017年6月，高彩霞课题组(X Meng 2017)发表了用CRISPR/Cas9构建水稻全基因组突变体文库的文章。为了有效地产生功能缺失型突变，研究者在起始密码子下游的ORF开始附近的外显子中设计了sgRNA靶位点。他们在每个候选基因中选择了前两个鉴定的sgRNA靶位点，筛选出在水稻基部组织(水稻表达谱数据库[RED])中高度表达的12802个基因的25604个相应的sgRNA，以产生大规模的突变文库。他们将sgRNA混合，通过PCR合成双链，再纯化，最后转入pVKmp-lib载体中，并将质粒转化入用卡那霉素选择标记的感受态细菌中。通过数据表明，作者获得的CRISPR/Cas9突变体文库具有低的脱靶效应。通过研究表明基于CRISPR/Cas9的筛选是用于系统鉴定水稻中的功能基因和突变表型的稳健方法。这里开发的突变文库对研究水稻基因功能和改良作物具有重要价值。

目前，在植物中，CRISPR/Cas9高通量的应用仅在水稻中有报道，棉花作为重要的纤维作物，至今尚无报道。近几十年我国在转基因抗虫棉培育、现代分子育种体系的建立和棉花品种高效应用保障技术等方面取得成就的同时，也面临着许多新的难题。包括优异的种植资源匮乏；棉花枯、黄萎病逐年加重；抗虫棉的普及引起次生害虫的危害增加；盐渍化田地逐年增加等。因此，利用CRISPR/Cas9高通量基因编辑技术构建棉花突变体库，深入探讨基因功能，了解棉花抗逆、抗病、抗虫分子机理，对为棉花抗性育种提供理论依据和候选基因具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于构建适合于陆地棉CRISPR/Cas9高通量基因编辑的系统。基于pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体(Wang P 2017)，构建了适合陆地棉高通量转化并具有高效编辑的载体Htkt(High-throughput-kan-tRNA)。

本发明技术方案如下所述：

一种基于CRISPR/Cas9系统高通量构建棉花突变体库的高通量载体Htkt，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：5所示。