[发明专利]基于CRISPR/Cas9系统高通量构建棉花突变体库的方法在审
| 申请号： | 201811393902.0 | 申请日： | 2018-11-21 |
| 公开（公告）号： | CN109517846A | 公开（公告）日： | 2019-03-26 |
| 发明（设计）人： | 郭小平;徐孝兰;张军 | 申请（专利权）人： | 华中农业大学 |
| 主分类号： | C12N15/90 | 分类号： | C12N15/90;C12N15/82;C12N15/66;A01H5/00;A01H6/60 |
| 代理公司： | 武汉宇晨专利事务所 42001 | 代理人： | 张红兵 |
| 地址： | 430070 湖*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 高通量 陆地棉 构建 突变体库 转化载体 基因组 棉花 植物基因工程技术 高通量测序 棉花基因组 靶标片段 基因片段 引物 克隆 覆盖率 应用 | ||
1.一种基于CRISPR/Cas9系统高通量构建棉花突变体库的高通量载体Htkt，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：5所示。
2.一种基于CRISPR/Cas9系统高通量构建棉花突变体库的载体Htkt的方法，其特征在于以下步骤：
(1)用带有接头的引物以PGTR4载体为模板扩增tRNA，PGTR4载体核苷酸序列如SEQ IDNO：6所示，扩增出的tRNA核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
(2)用带有接头的引物从PK2GW7.0载体中扩增CcdB，PK2GW7.0载体核苷酸序列如SEQID NO：7所示，扩增出的CcdB核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
(3)以步骤(1)、步骤(2)所得的产物为模板进行PCR并拼接成tRNA-CcdB，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
(4)用限制性酶Bsa1酶切核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的载体pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ，与步骤(3)的拼接的产物进行连接，热击到DB3.1大肠杆菌感受态，用引物U6-7S进行测序，得到核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的高通量棉花突变体库的载体Htkt；
其中：
步骤(1)中所述的接头引物的序列为：
tRNA-S：AAGAAGCATCAGATGGGCAAACAAAGCACCAGTGGT，和
tRNA-AS：CTGCATCGGTCTCCTGCACCAGCCGGG；
步骤(2)中所述的接头引物的序列为：
CcdB-2S：GGCAGGAGACCGATGCAGTTTAAGGTTTACAC，和
CcdB-AS：TTCTAGCTCTAAAACCGAGACCTTTATATTCCCCAGAACATCAGGT；
步骤(4)中的引物的序列为：U6-7S：TGTGCCACTCCAAAGACATCAG。
3.权利要求1所述的载体Htkt在陆地棉基因编辑中的应用，其特征在于以下步骤：
(1)对陆地棉基因进行sgRNA设计；
(2)将所得的50条sgRNA混合成一管，得到混合sgRNA；
(3)利用重叠延伸PCR扩增sgRNA双链；
(4)对Htkt载体进行酶切；
(5)将sgRNA双链片段与Htkt酶切载体进行连接；
(6)电击转化农杆菌，进行高通量测序。
4.权利要求1所述的载体在陆地棉基因组编辑中的应用。
5.权利要求2所述的方法在陆地棉基因组编辑中的应用。
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