[发明专利]一种化学交联剂及其制备和应用

权利要求书

1.一种化学交联剂，其特征在于：同时具有氨基酸骨架、同位素标记以及富集功能基团，其结构式为：

其中，n取值范围为1-5，对应不同碳链长度的氨基酸骨架；氨基酸骨架引入同位素标记，包括氘、碳13或氮15中的一种或两种以上；R为化学富集基团，包括炔基、叠氮或生物素中的一种。

2.根据权利要求1所述的化学交联剂，其特征在于：

以不同碳链长度的氨基酸为骨架结构，包括两种天然氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸；三种非天然氨基酸：2-氨基-1,6-己二酸、2-氨基-1,7-庚二酸、2-氨基-1,8-辛二酸；氨基酸骨架引入同位素标记，包括氘、碳13或氮15中的一种或两种以上，实现化学交联质谱技术与蛋白组学定量技术结合，获取细胞内蛋白的时空动态变化信息；化学交联剂具有两个琥珀酰亚胺酯结构单元，高效温和地与蛋白质、多肽赖氨酸末端或N端氨基发生反应，实现蛋白质的快速交联；化学交联剂具有化学富集基团，包括炔基、叠氮或生物素中的一种，通过富集方式提高交联肽在质谱中的响应，实现交联肽高通量、高灵敏度分析；化学交联剂具有电中性、疏水结构，交联剂穿过细胞膜到达细胞质及各个亚细胞器，实现细胞内蛋白原位化学交联，获取高可信度的蛋白三维结构以及蛋白-蛋白相互作用信息。

3.根据权利要求1所述的化学交联剂的制备方法，其特征在于，具体过程如下：

(1)

(2)

(3)

步骤一，具有富集基团R的羧酸为起始原料，乙二酰氯为酰化试剂，N,N-二甲基甲酰胺，以下简称DMF，为催化剂，无水二氯甲烷为反应溶剂，制备富集基团酰氯试剂；

步骤二，以1-5不同碳链长度或同位素标记的氨基酸为原料，在饱和碳酸氢钠溶液中，与步骤一新制备的富集基团酰氯发生酰胺化反应，浓盐酸调反应液为酸性，制备修饰富集基团的二羧酸化合物；

步骤三，以步骤二制备的修饰富集基团的二羧酸化合物为原料，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，以下简称EDCI，为缩合剂，与N-羟基琥珀酰亚胺，以下简称NHS，发生酯化反应，即制得不同碳链长度氨基酸骨架同位素标记富集型化学交联剂。

4.根据权利要求3所述的化学交联剂的制备方法，其特征在于：步骤一中将具有富集基团的羧酸溶于无水二氯甲烷中，加入0.01-0.1mL DMF，反应液降温至0-5℃，取乙二酰氯滴加至反应液，乙二酰氯与富集基团的羧酸摩尔比控制在1：1至1.5：1，滴毕，反应液升温至15-25℃，继续反应1-2h，即制得具有富集基团的酰氯试剂。

5.根据权利要求3所述的化学交联剂的制备方法，其特征在于：步骤二中将不同碳链长度或同位素标记的氨基酸溶于饱和的碳酸氢钠中，氨基酸与碳酸氢钠摩尔比控制在1：3至1：5，反应液降温至0-5℃，滴加步骤一新制备的具有富集基团的酰氯试剂，氨基酸与具有富集基团的酰氯试剂摩尔比控制在1：1.1至1：1.3，滴毕，反应液升温至15-25℃，继续反应1-2h，反应毕，饱和氢氧化钠溶液调反应液pH为10-12，用乙酸乙酯洗水相，洗毕，浓盐酸调反应液pH为1-3，用乙酸乙酯萃取水相，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂，粗产物二氯甲烷重结晶，即制得修饰富集基团的二羧酸化合物。

6.根据权利要求3所述的化学交联剂的制备方法，其特征在于：步骤三中将修饰富集基团的二羧酸化合物、EDCI与NHS置于无水二氯甲烷中，三者的摩尔比控制在1：2.2：2.2至1：3.0：3.0，20-25℃搅拌12-24h，反应毕，减压蒸干有机溶剂，将粗产物溶于二甲基亚砜，以下简称DMSO，以水、乙腈为流动相，碳十八硅球为填料，利用半制备反相色谱分离纯化即制得不同碳链长度氨基酸骨架具有同位素标记富集型的化学交联剂。

7.权利要求1所述的化学交联剂的应用，特点在于：细胞内原位蛋白复合体的规模化分析、细胞内亚细胞器蛋白质复合物规模化分析、细胞内原位目标蛋白质复合物分析、蛋白质的空间结构解析、蛋白质-蛋白质相互作用解析或蛋白质时空动态变化分析过程中。