[发明专利]构建ABCA1基因敲除仓鼠模型的试剂盒和方法

说明书

本发明公开了构建ABCA1基因敲除仓鼠模型的试剂盒和方法，所述试剂盒包括sgRNA，所述sgRNA由如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示人工序列经PCR扩增、体外转录所得。所述方法包括：设计仓鼠ABCA1基因特异性打靶序列、制备cas9 mRNA和sgRNA；收集和培养仓鼠受精卵；显微注射：将sgRNA和cas9 mRNA共同注射至仓鼠受精卵的细胞质中；将显微注射后的受精卵植入代孕仓鼠体内，F0代仓鼠出生。经鉴定该方法成功构建了ABCA1基因敲除仓鼠模型，能够为研究ABCA1与冠心病的关系提供研究基础。

技术领域

本发明涉及疾病动物模型及其制备技术领域，具体地，涉及一种心血管疾 病动物模型及其构建方法，尤其是构建ABCA1基因敲除仓鼠模型的试剂盒和 方法。

背景技术

冠状动脉粥样硬化性心脏病(Coronary atherosclerotic heart disease，CHD，简称冠心病)的患病率和死亡率呈逐年上升趋势。动脉粥样硬化 (Atherosclerosis，As)作为冠心病的主要病理学基础，其发生是一个多因素参 与的复杂过程，其中血管壁胆固醇过量蓄积和炎症反应是两个相互促进的关键 环节，因此，抑制血管炎症和减少巨噬细胞内胆固醇蓄积是防治As的重要措 施。三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)在胆固醇逆转运和高密度脂蛋白 (HDL)生成的起始步骤中起重要作用，它是介导胆固醇流出的关键蛋白，也是As防治的重要靶点。ABCA1以ATP为能源，促进细胞内游离胆固醇和磷脂流 出，并结合到细胞表面乏脂的载脂蛋白AI(Apolipoprotein AI，apoAI)，形成 新生的高密度脂蛋白(High-density lipoprotein，HDL)，对于减少血管壁脂质 蓄积泡沫细胞形成和血管壁炎症反应均具有重要意义。

人类ABCA1基因敲除可导致血浆HDL水平降低，增加冠心病风险。多个临 床研究发现，ABCA1基因至少存在50多种突变，这些突变导致的最常见疾病是 丹吉尔病和家族性HDL缺乏症(Familial HDL deficiency，FHA)，该类疾病表 现出低HDL水平、胆固醇蓄积于外周和早发性As，其冠心病发病率是正常人群 的6倍。然而，临床研究和动物实验的许多结果并不一致，如，以小鼠为模型的 研究发现，ABCA1突变虽能降低血浆HDL，但并不形成As；且ABCA1突变模 型小鼠与As模型小鼠杂交的双基因敲除动物在喂饲高脂饲料后，亦不促进As病 变，更没有冠心病发生，与人类疾病明显不符。而大动物模型存在经济成本、 时间成本、伦理审查要求过高，实验操作便利性差的问题。上述情况导致以 ABCA1为靶点进行As防治的研究没有重要进展。

发明内容

针对现有技术中缺乏与人类脂代谢接近的ABCA1基因敲除动物模型、小 鼠模型与人类临床表现明显不符、大动物模型存在经济成本和、时间成本、伦 理审查要求过高以及实验操作便利性差的技术问题，本发明提供构建ABCA1 基因敲除仓鼠模型的试剂盒。

以及，本发明还提供采用上述试剂盒构建ABCA1基因敲除仓鼠模型的方 法。

为实现上述目的，本发明实施例提供了构建ABCA1基因敲除仓鼠模型的 试剂盒，该试剂盒中包括sgRNA，所述sgRNA由如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示人工序列经PCR扩增、体外转录所得。

该试剂盒以仓鼠为动物模型，其原因在于：仓鼠脂蛋白组成、载脂蛋白含 量及分布、脂代谢特点、As易感性等与人类高度相似，血浆中有较高的低密度 脂蛋白，与小鼠相比，仓鼠对高脂饮食的高反应性更接近人类，高脂饲料可使 仓鼠血TG和胆固醇皆明显升高，易诱导发生肥胖、胰岛素抵抗、动脉粥样硬 化病变，且病变斑块性质与人类相似。同时仓鼠还具有易于操作、成本低、易 繁殖的特点。因此，我们以仓鼠为对象构建ABCA1基因敲除仓鼠模型，用于 研究ABCA1对脂代谢、As、冠心病等的作用。仓鼠基因序列与小鼠等其他动 物不同，因此我们对人工序列进行设计，用如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所 示人工序列经PCR扩增、体外转录制成sgRNA，使含有该sgRNA的试剂盒可 用于构建ABCA1基因敲除仓鼠模型。