[发明专利]构建ABCA1基因敲除仓鼠模型的试剂盒和方法

权利要求书

1.构建ABCA1基因敲除仓鼠模型的试剂盒，其特征在于，包括sgRNA，所述sgRNA由如SEQID NO:2和SEQ ID NO:3所示人工序列经PCR扩增、体外转录所得。

2.如权利要求1所述的构建ABCA1基因敲除仓鼠模型的试剂盒，其特征在于，所述sgRNA的制备步骤为：采用所述SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3人工序列经PCR扩增，取扩增产物中124bp的DNA片段作为sgRNA的DNA模板，所得的sgRNA的DNA模板经体外转录得sgRNA粗品。

3.如权利要求1或2所述的构建ABCA1基因敲除仓鼠模型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括cas9 mRNA，其制备步骤为：采用含有人源化cas9 cDNA的PXT7质粒，经XbaI限制性内切酶作用，纯化得cas9 mRNA的DNA模板，所得cas9 mRNA的DNA模板经体外转录得cas9mRNA粗品。

4.如权利要求3所述的构建ABCA1基因敲除仓鼠模型的试剂盒，其特征在于，所述cas9mRNA的制备中：

cas9 mRNA的DNA模板纯化的方法为：PXT7质粒经XbaI限制性内切酶处理后，用蛋白酶K处理20～50min，经酚-氯仿抽提，乙醇沉淀；和/或

cas9 mRNA的DNA模板体外转录的条件为：采用mMESSAGE mMACHINE T7kit试剂盒，在37℃反应1～3小时；和/或

所得cas9 mRNA粗品的纯化方法为：cas9 mRNA粗品经酚-氯仿抽提、异丙醇沉淀、无RNase水溶解，得浓度为200～800ng/μL的cas9 mRNA。

5.如权利要求2所述的构建ABCA1基因敲除仓鼠模型的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：

98℃30s；

98℃10s，56℃30s，72℃15s，共35个循环；

72℃10min。

6.如权利要求2所述的构建ABCA1基因敲除仓鼠模型的试剂盒，其特征在于，所述sgRNA的制备中：

所得sgRNA的DNA模板的选取和纯化方法为：所述PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒回收124bp的DNA条带，再经蛋白酶K处理20～50min，酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，得sgRNA的DNA模板；和/或

所得sgRNA粗品纯化的方法为：用MEGAclear Kit试剂盒进行纯化，无RNase水溶解为浓度100～500ng/μL的sgRNA。

7.如权利要求2所述的构建ABCA1基因敲除仓鼠模型的试剂盒，其特征在于，sgRNA的DNA模板体外转录的条件为：采用Megascript T7Kit试剂盒，在37℃反应3～5h。

8.采用权利要求1～7任一项所述的试剂盒构建ABCA1基因敲除仓鼠模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、设计仓鼠ABCA1基因特异性打靶序列，如SEQ ID NO:1所示；以含有人源化cas9cDNA的PXT7质粒制备cas9 mRNA，采用如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示人工序列经PCR反应和体外转录制得sgRNA；

步骤二、收集和培养仓鼠受精卵；

步骤三、将步骤一中所制得的sgRNA和cas9 mRNA注射至仓鼠受精卵的细胞质中，得到ABCA1基因敲除的受精卵；

步骤四、将ABCA1基因敲除的受精卵，植入代孕仓鼠体内，F0代仓鼠出生，鉴定。

9.如权利要求8所述的构建ABCA1基因敲除仓鼠模型的方法，其特征在于：步骤三中，所述sgRNA和cas9 mRNA的注射浓度分别为10ng/μL和20ng/μL。