[发明专利]一种提高发酵罐制备酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶表达量的新方法

说明书

本发明公开一种提高发酵罐制备酿酒酵母细胞表面展示α‑半乳糖苷酶表达量的新方法。本发明通过向10L的发酵罐体系中酿酒酵母细胞表面展示α‑半乳糖苷酶的诱导培养基里加入限定浓度的硫酸铵0.05‑0.5％，并创新地以持续流加的方式补充诱导剂使其浓度维持在1‑3％，实现酿酒酵母的菌体生长量及酿酒酵母细胞表面展示α‑半乳糖苷酶表达量的大幅提高。采用本发明的方法，酿酒酵母细胞表面展示α‑半乳糖苷酶的单位酶活性及回收总酶活性是一般培养的3.7倍和7.9倍。为工业化制备生产酿酒酵母细胞表面展示α‑半乳糖苷酶提供了新途径。

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，具体涉及一种提高发酵罐制备酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶表达量的方法。

背景技术

α-半乳糖苷酶(α-galactosidase,EC3.2.1.22)属外切类糖苷酶，广泛存在于植物、动物和微生物中，可专一性催化半乳低聚糖和多糖中α-1,6半乳糖苷键的水解。在食品工业、饲料工业、医疗制药业、轻工业等领域具有广泛的应用。目前市场中，天然提取的或异源表达的α-半乳糖苷酶存在稳定性差，分离纯化步骤多，成本高，不能重复利用的问题。

酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶是将α-半乳糖苷酶锚定于酿酒酵母细胞表面，免去了纯化与固定的步骤，解决了目前市场中天然提取的或异源表达的α-半乳糖苷酶稳定性差，分离纯化步骤多，成本高，不能重复利用的现实问题，且酿酒酵母作为GRAS级菌株，可安全使用于食品医药领域。目前酿酒酵母细胞表面展示表达酶蛋白仍存在表达活性不高，产量偏低等缺陷。已报道的在酵母细胞表面展示系统中表达的木聚糖酶活力最高为137U/g，漆酶为159U/g，酶活力的表达尚不能达到理想水平。

发酵罐培养是大量制备微生物菌体及其代谢产物的常用方法，可以缩短发酵周期，提高生产效率，降低生产成本，在大肠杆菌基因工程菌及毕赤酵母基因工程菌的大量培养中有广泛的应用。酿酒酵母细胞表面展示菌株由于受到自身培养条件及诱导条件的限制，通过发酵罐大量制备酿酒酵母细胞表面展示酶蛋白的成功案例尚未见报道。

发明内容

本发明针对现有技术中酿酒酵母细胞表面展示酶蛋白存在的大量培养及表达的问题，公开一种提高发酵罐大量培养酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶表达量的新方法。

本发明采用的技术方案是：一种提高发酵罐制备酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶表达量的新方法，包括如下步骤：

1)制备种子液：将酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶基因工程菌株置于含葡萄糖的YNB-CAA培养基中，培养至菌体OD₆₀₀＝2.0～3.0时，回收菌体，得种子液；

2)诱导表达：于10L发酵罐中，将种子液以2～5％的接种量，接种于含半乳糖和补充氮源的YNB-CAA培养基中，搅拌转速为100rpm，以0.5L/min速度通入空气，20～30℃下，诱导表达30～40h，离心收集菌体。

进一步的，上述的一种提高发酵罐制备酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶表达量的新方法，步骤2)中，在诱导表达全过程中，以流加方式持续加入半乳糖，保持10L发酵罐中，培养基中半乳糖浓度为1～3％。

进一步的，上述的一种提高发酵罐制备酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶表达量的新方法，所述的酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶基因工程菌株的制备方法如下：将α-半乳糖苷酶基因与载体pYD1连接后获得重组质粒，将重组质粒转化至酵母EBY100中，获得酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶基因工程菌株。

进一步的，上述的一种提高发酵罐制备酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶表达量的新方法，步骤1)中，所述的含葡萄糖的YNB-CAA培养基的组成为：0.67％YNB，0.5％酸水解酪蛋白，2％葡萄糖，余量水。