[发明专利]酪蛋白-羧甲基壳聚糖糖基化纳米粒的制备及其应用

说明书

本文涉及一种新型复合糖基化改性方法，以酪蛋白和羧甲基壳聚糖为原料，制备一种接枝度高、热稳定性好的共聚物，并应用于对EGCG的包封，旨在提高EGCG的稳定性和缓释性能。具体方法如下：首先对酪蛋白采用微波湿法进行多糖接枝改性，然后在初级湿法产物上再进行干法改性，得到接枝率为80.5％的糖基化产物，并通过均质法对EGCG进行负载和包封形成三元复合物，该复合物对EGCG的最大包封率为79.68％，能够显著延缓热处理和储藏期间内EGCG抗氧化下降的速率，在肠胃液中缓慢释放EGCG，有效避免了突释现象，可广泛应用于食品、保健品等行业。

技术领域

酪蛋白-羧甲基壳聚糖糖基化纳米粒的制备及应用于负载和包封EGCG，属于功能性保健食品纳米胶囊技术领域。

背景技术

酪蛋白是牛奶中含量最丰富、营养价值最高的全蛋白，且营养成分的消化吸收率极高。酪蛋白分子在溶液中可以自主装形成胶束，结构稳定，使其非常适合作为载体运送各种生物营养物质。但酪蛋白的自主装行为容易受到复杂结构的营养物质以及输送环境的影响，因此改性酪蛋白能够赋予蛋白质人为设计的附加性能，提高了营养物质的生物供给率。

美拉德反应是蛋白质上的氨基与多糖上的羧基进行的反应，主要有两种方法：干热法和湿热法。干热法即将一定比例的蛋白质和多糖混合溶于缓冲溶液中，搅拌均匀后冷冻干燥，将产物研磨成细腻颗粒，在一定的对湿度(65％或79％)和温度(一般为40-80℃)相下加热，加热时间依据蛋白质和多糖的结构性质而定，反应时间大多为几小时至几周。干法大多适用于蛋白质和多糖之间的接枝反应，反应进程容易控制，且得到的产物接枝率较高，热稳定性好，接枝反应中加入多糖比单糖或双糖对改善蛋白质的功能特性更显著。湿法一般是将蛋白质和糖溶于缓冲溶液中然后混合均匀后在高温下反应，主要用于单糖和寡糖。反应具有温度高，速度快的特点，但反应程度不易控制，生物大分子在溶液中存在位阻效应会有立体效应，这种效应导致其化学反应具有强烈的取向性，另外水分子也会阻碍糖基化反应中Amadori重排产物的生成，因此反应进程发展到一定程度会受到抑制，而且接枝物的颜色较深，不利于广泛的应用。

显然，两种糖基化方法各有优缺点，单一的改性方式也存在诸多不足，效果有限，无法满足现代食品工艺对蛋白质功能越来越高的要求。微波是一种频率300MHz至300GHz的电磁波，能够引起极性分子快速振动从而对分子产生作用。微波作为一种新型的加热辅助方式已被广泛应用于蛋白改性等领域，尤其是在微波辅助水解、微波改性等领域的运用，所以新型的复合改性技术成为以后蛋白质改性的主要发展方向。

表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是绿茶中最重要的生物活性成分，在许多研究中都证实了它的抗癌活性。然而，EGCG性质很不稳定，容易受光、氧、温度、pH等外界因素的影响而发生变化，EGCG容易被降解，其生物利用率极低。纳米粒子技术已被广泛运用，与传统的食品相比，具有更高的生物利用率、稳定性、缓释性等，是食用研究的前沿和热点。已有较多的研究表明，多类材料可用于制备纳米粒子作为EGCG载体，并在改善EGCG生物活性方面效果显著，而目前，蛋白质多糖已成为纳米载体材料研究最深入的生物材料之一，许多研究证明茶多酚中的EGCG能与多糖、蛋白质发生非共价和共价结合，通过自组装过程可形成稳定的纳米复合物，从而可以提高多酚的溶解性、稳定性，比普通茶多酚具有更强的活性，应用范围更加广泛。

发明内容

本发明提供了一种新型复合糖基化改性方法，即微波辅助湿法-干法联用，使得酪蛋白对羧甲基壳聚糖的接枝度和热稳定性显著提高，且方法简单，易操作控制。

将制备的糖基化产物通过均质法应用于对EGCG的负载和包封，最高包封率达到79.68％，负载后的EGCG抗氧化稳定性、热稳定性、储藏稳定性以及酸碱稳定性得到显著提高，且在肠胃液中糖基化产物对EGCG具有缓释效果，解决了EGCG的突释问题。

本发明采用的技术方案如下：一种糖基化酪蛋白-羧甲基壳聚糖共聚物的制备方法，包括下述步骤：

(1)湿法制备酪蛋白-羧甲基壳聚糖糖基化产物