[发明专利]一种针对KRAS基因突变检测的试剂盒

说明书

本发明提出了一种新的针对KRAS基因突变检测的试剂盒，运用了双相酶系统RNase H2和DNA聚合酶技术，由于采用的是双酶系统扩增法，在普通引物的基础上有所改变，即在引物序列SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7的3'端连接有间隔臂x，这样使引物能够特异地与模板序列结合，并在RNase H2剪切后能特异扩增；设计了针对KRAS基因突变位点的引物探针，采用荧光PCR，封闭式检测，减少了后期污染的可能性；本发明提供的试剂盒的敏感度高，检测快速，稳定性好，封闭式检测，减少了后期污染的可能性。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种针对KRAS基因突变进行检测的试剂盒。

背景技术

KRAS属于Ras基因家族主要成员之一，位于EGFR信号通路的下游。KRAS编码P21蛋白，在MAPK信号通路中起作用，是一种致癌基因，能够与GDP/GTP结合并促进GTP酶活性。当KRAS发生突变时不能被水解酶水解失活，并处于持续激活状态，可以引起RAF/MAPK的上调，传递多种生存通路信号，从而使细胞过度生长、增殖，抑制EGFR-TKIs的作用。17％到25％人类肿瘤中存在KRAS基因的突变，其突变可以导致多种恶性肿瘤，包括胰腺(95％)，甲状腺(55％)，大肠癌(35％)，肺癌(35％)等。KRAS基因被激活最常见的方式是点突变，多发生在N端的第12、13和61、146密码子，其中以第12密码子突变最常见。Ras家族基因在癌症中没有可用的药物直接拮抗此靶点，主要影响信号通路上下游靶点药物的使用效果，突变主要导致EGFR靶向药，BRAF靶向药的耐药性等。

全球结直肠癌每年新发病例数约120万，年病死人数超过60万，发病率居第4位。近些年，结直肠癌的发病率呈明显上升趋势。早在2009年，美国临床肿瘤学会(ASCO)即建议对于转移性结直肠癌患者，在选择抗EGFR的单抗药物(西妥昔单抗或帕尼单抗)治疗前应检测KRAS基因状态。多个大样本、多中心III期临床研究结果提示，KRAS基因第2号外显子第12、13位密码子的突变状态与阻断EGFR的单克隆抗体——西妥昔单抗、帕尼单抗的疗效明确相关，KRAS野生型的患者可以从西妥昔单抗和帕尼单抗的治疗中获得最大化的生存效益。

KRAS基因突变发生在大约30％的肺腺癌中。肺癌KRAS突变主要定位在第12和13号密码子。同时，肺癌中的KRAS突变似乎与EGFR和ALK易位互不相容，众多研究显示，KRAS基因突变是影响TKI药物疗效的不利因素。此外，也有研究表明，KRAS突变患者通常都有吸烟史。虽然KRAS的发现比EGFR早二十多年，但由于研发难度大，目前针对KRAS的靶向药物少之又少。2013年《NCCN非小细胞肺癌临床实践指南》明确指出：肿瘤患者接受EGFR靶向药物治疗之前，必须进行RAS基因突变检测，根据检测结果决定是否使用EGFRTKI靶向药物作为临床治疗措施。新的指南规定，RAS基因如果发生了突变，则不建议病人使用EGFR TKI进行分子靶向治疗。在携带KRAS突变的肺癌临床研究显示，KRAS突变与肺癌患者对吉非替尼和厄洛替尼原发耐药相关，携带KRAS突变的患者在厄洛替尼治疗中显示出较差的疗效。

体细胞突变目前最常用的方法是ARMS-PCR法，即扩增受阻突变系统荧光PCR法，该方法主要用来检测点突变，尤其是检测突变含量很低的体细胞突变。

荧光PCR的优点是反应灵敏、特异性高：具有模板序列特异的Taqman探针在引物特异的基础上进一步提高了PCR的专一性；每扩增一个特异产物只释放一个分子的荧光染料，仪器检测的是特异扩增的结果，非特异产物对检测信号没有影响，有效提高检测的专一性。有多种不同波长的荧光基团对可供选择，使得Taqman探针法可以实现在同一管内检测多重PCR，降低成本也提高效率和准确性避免了荧光染料对PCR反应的影响。