[发明专利]一种快速鉴定感染日本血吸虫钉螺的方法

说明书

本发明公开了一种快速鉴定感染日本血吸虫钉螺的方法，包括快速无毒无害无需清洗纯化的阳性钉螺DNA提取方法和RAA快速检测阳性钉螺DNA方法。本发明包括快速无毒无害无需清洗纯化的阳性钉螺DNA提取方法，避免使用苯酚、氯仿等有毒有害化学物质进行提取DNA，也不需要使用蛋白酶K、异硫氰酸胍等复杂昂贵的裂解液成份，操作步骤少，方便快捷，成本低廉。

技术领域

本发明涉及分子生物学检测领域，具体涉及到快速提取感染日本血吸虫钉螺中日本血吸虫DNA及基于RAA技术的荧光快速检测方法。

背景技术

日本血吸虫病是世界性分布的人兽共患寄生虫病，是世界卫生组织(WHO)界定的“六大热带病之一”，也是我国五大寄生虫病之一。日本血吸虫病是由尾蚴感染接触疫水的人和动物等终宿主引起的。

日本血吸虫(Schistosomajaponicum)属于扁形动物门、吸虫纲、复殖目、裂体科、裂体属、日本种，雌雄异体。雄虫平均长13mm，雌虫平均长15mm。虫卵圆形，淡黄色，卵壳薄，无盖，在其侧方有一小刺，成熟的卵内含毛蚴。毛蚴呈长椭圆形，卵内毛蚴在水中孵出，侵入钉螺，钉螺是其唯一的中间宿主，所以日本血吸虫病的流行地理分布和钉螺的地理分布相一致，有一定的地方性。血吸虫的基因组由8对染色体组成，其中7对为常染色体，1对性染色体。

在我国血吸虫病的病原是日本血吸虫，我国血吸虫病主要分布在江苏、浙江、上海、安徽、江西、湖南、湖北、四川、云南、广西、广东、福建等12个省的433个县(市、区)，共有钉螺面积148亿平方米，累计感染者达1160万例，受威胁人口在1亿以上。我国的血吸虫病经过60年的积极防治，全国的血吸虫病疫情已得到有效控制，但近年来由于生物、自然、社会经济、人口流动、政策保障等因素变化较大，一些地方呈现血吸虫病疫情扩散蔓延的态势，表现为老疫区血吸虫病患者增加，钉螺扩散明显，新钉螺区出现，感染性钉螺分布范围扩大，部分已达血吸虫病传播控制和传播阻断的地区可能出现疫情回升，各地输入性血吸虫病病例增加，我国的血吸虫病防治工作还任重道远。

在血吸虫病的防控中，诊断与检测工作显得更为重要，特别是针对钉螺是否感染血吸虫的鉴定是致关重要的一环，它为防治活动的计划、实施和防治效果评价等个环节提供必要的信息和科学依据。

由于钉螺是血吸虫的唯一中间宿主，是血吸虫病的唯一的传播媒介，消灭血吸虫感染性钉螺可以阻断血吸虫病的传播与流行。因此准确鉴定钉螺是否感染血吸虫是防控血吸虫病的关键。

目前检测血吸虫感染性钉螺的方法有多种：

1.肉眼观察法

在自然光线下或人工灯光照射下，通过观察钉螺的第4螺层以下的螺壳顏色与透光度的变化，以及钉螺肝组织与螺壳之间有无间隙来判断钉螺是否感染血吸虫。这个方法虽然简便易行，但需要大量的有经验技术人员进行人为判断，误差大，准确性只有60％左右，漏检率高，不能鉴定血吸虫感染早期的钉螺，且工作量大现场开展困难等。

2.压片镜检法

将钉螺外壳压碎，使钉螺软组织暴露出来，显微镜下通过观察钉螺组织中是否有血吸虫母胞蚴或尾蚴来判断钉螺是否感染了血吸虫。此方法对技术人员要求较高，而且准确率较低，容易出现鉴别错误：而钉螺感染后，由于血吸虫发育需要时间，显微镜检最早的时间在9天，特别是现场采集的钉螺，也需要在实验室饲养一段时间，才能够通过显微镜判定，时效性太差，对于处于血吸虫感染旱期阶段钉螺仍不能检出，检测过程需要使用显微镜不便于血吸虫病防治现场使用，不能满足当前血防工作的需求。

3.孵化法

将钉螺置于盛有清水的试管或其它玻璃容器中，室温下(22-25℃)孵育2-3小时，观察钉螺体内是否有血吸虫尾蚴孵出，以判断是否是血吸虫感染性钉螺。该方法同样操作简便，对血吸虫感染晚期的感染性钉螺检测出率高，但同样不能检出血吸虫感染早期的钉螺。

4.循环抗原检测法