[发明专利]一种快速鉴定感染日本血吸虫钉螺的方法

权利要求书

1.一种快速鉴定感染日本血吸虫钉螺的方法，其特征在于：

包括快速无毒无害无需清洗纯化的阳性钉螺DNA提取方法和RAA快速检测阳性钉螺DNA方法；

所述快速无毒无害无需清洗纯化的阳性钉螺DNA提取方法的步骤如下：

1)、将钉螺研磨碎后挑去壳置于离心管中，加入溢过钉螺软体足量清洗液A，震荡混匀，12000rpm离心2min，倒去上清；

所述清洗液A的组分为NaCl和Na₃C₆H₅O₇；

其中NaCl的质量百分浓度为0.1-1.5％；Na₃C₆H₅O₇的质量百分浓度为1-2.5％。

2)、用研磨棒将钉螺组织进行充分研磨；

3)、向上述离心管中加入500μL裂解液B，震荡混匀，80℃水浴锅中静置5-10min；

所述裂解液B的组分为NaOH、Triton X-100、SDS、PH为8.0的EDTA；其中NaOH的体积摩尔浓度为0.1-1mol/L，Triton X-100的质量百分浓度为0.2-2％，SDS的质量百分浓度为0.1-0.4％，EDTA的体积摩尔浓度为0.1-0.5mmol/L；

4)、将经过水浴后的离心管置于离心机中，12000rpm离心5min，取400μL上清于一新的离心管中，加入160μL Buffer C，震荡混匀，12000rpm离心5min，将上清转移至一新的离心管中，-20℃保存备用，完成DNA提取，所述Buffer C组成为CH₃COOH，CH₃COOH的体积摩尔浓度为1-2mol/L；

RAA快速检测阳性钉螺DNA方法，包括特异性引物和荧光探针；

特异性正向引物序列：

5’-TCATCTCTGATCTGTATGCCTTTCCATTAG-3’,

特异性反向引物序列：

5’-AGTTAACTAAAAGTCAGTCAGTCACTTACAACG-3’；

所述荧光探针序列为：

5’-TACTCTGTTACTACCTCCTCTACTCTGGGATCTGGTCCGAAAATTT-3’

所述荧光探针分别标记有一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，所述报告荧光基团为FAM荧光基团；所述的猝灭荧光基团为BHQ；经过荧光基团修饰后的探针为：

5’-TACTCTGTTACTACCTCCTCTACTCTGGGA/i6FAMdT//THF//iBHQdTGGTCCGAAAATTT-3’；

等温扩增的温度为35～42℃；

等温扩增的时间为5～20min；

扩增体系的体积为25～100μL；

血吸虫样本DNA加样量的体积为1～5μL；

使用正向引物浓度0.02～0.1mM，反向引物浓度0.02～0.1mM；

探针的浓度为0.02～0.07mM。

2.根据权利要求1所述的一种快速鉴定感染日本血吸虫钉螺的方法，其特征在于：所述清洗液A中NaCl的质量百分浓度为0.9％，Na₃C₆H₅O₇的质量百分浓度为1.5％。

3.根据权利要求1所述的一种快速鉴定感染日本血吸虫钉螺的方法，其特征在于：所述裂解液B中NaOH的体积摩尔浓度为0.3mol/L，Triton X-100的质量百分浓度为1％，SDS的质量百分浓度为0.2％，EDTA的体积摩尔浓度为0.1mmol/L。

4.根据权利要求1所述的一种快速鉴定感染日本血吸虫钉螺的方法，其特征在于：所述Buffer C中CH₃COOH的体积摩尔浓度为1.2mol/L。

5.根据权利要求1所述的一种快速鉴定感染日本血吸虫钉螺的方法，其特征在于：所述等温扩增的温度为39℃；所述等温扩增的时间为20min；

所述扩增体系的体积为50μL；

所述血吸虫样本DNA加样量的体积为2μL；

正向反向引物浓度为0.05mM，加入正向反向引物体积各2μL；

探针的浓度为0.03mM；使用体积为0.5μL。