[发明专利]重组Martentoxin的制备、表征及应用

说明书

本发明涉及重组Martentoxin的制备及表征。具体地，本发明将Martentoxin基因与载体pETDuent‑1连接得到重组表达载体pETDuent‑1‑MarTX，将该重组表达载体转化至E.coli Origami B(DE3)，筛选得到高效表达菌株。通过诱导表达、亲和层析纯化及表征，获得了各方面理化性质均正确的多肽—重组MarTX毒素。经电生理实验测定发现，本发明提供的重组MarTX毒素具有生物活性，可显著抑制大电导钙离子和电压激活的钾离子(BK)通道电流。本发明实现了MarTX毒素的绿色制造，获得的MarTX毒素产量高、纯度高，并且具有较高的生理活性。

技术领域

本发明涉及重组Martentoxin的制备、表征及应用，属于多肽毒素和生物技术工程领域。具体地，本发明涉及一种从东亚钳蝎(Buthus martensi Karsch,BmK)毒液中分离纯化得到的毒素—Martentoxin的重组制备技术和理化性质的表征，以及该重组毒素在大电导钙离子和电压激活的钾离子(BK)通道中的应用。

背景技术

研究表明，蛇、蜈蚣、蝎子、蜘蛛、海葵、锥螺等有毒生物的毒液中含有大量具有药理活性的多肽。目前有多种含分子内二硫键的毒液衍生物通过FDA批准，治疗高血压、疼痛及糖尿病[Venoms to drugs:venom as a source for the development of humantherapeutics[M].City:Royal Society of Chemistry,2015]。更多毒素分子正处于临床研究中，它们靶向癫痫、癌症和自身免疫等疾病[Curr.Pharm.Des.2007,13,2927-2934；Toxins 2010,2,2851-2871；Expert Opi.Biol.Ther.2011,11,1469-1484]。

东亚钳蝎(Buthus martensi Karsch,BmK)的蝎毒中富含多种具有天然活性的多肽，其中大部分可作用于离子通道。迄今为止，该蝎毒通过分离纯化已获得14种短链钾离子通道阻断剂(BmTX1-3、BmKTX、BmP01-3、BmP05、BmP09、BmKK1-4和Martentoxin)[Biochemistry 1997,36,13473-13482；J.Biol.Chem.2004,279,34562-34569；Eur.J.Biochem.1997,245,457-64]。这种Martentoxin(简称MarTX)由37个氨基酸构成，具有三对二硫键，是一种特异性作用于BK通道的短链多肽毒素[J.Neurochem.2003,84,325-335]，可显著抑制神经型(α+β4)BK通道电流。

目前，人工获取多肽的方法主要有三种：重组表达法、内源提取法和化学合成法。其中，内源提取法是最古老也最直接的方法，但提取出的多肽种类有限，产量较低。应用最多的化学合成法为Fmoc(9-芴甲氧羰基)固相合成法。该方法涉及线性肽链的合成、碘氧化体系、半胱氨酸的保护与保护基的脱除、以及变复性等诸多有机体系，步骤繁琐复杂，二硫键易错配，产率低下，且未能实现多肽类药物的绿色制造。而对于重组表达法，由于MarTX毒素分子量较小，且含多对二硫键易导致包涵体表达，因此运用该方法较难获得大量的、可溶的、高纯度蛋白。

因此，本领域迫切需要开发一种MarTX毒素的制备方法，以获得高产量、高纯度和高活性的MarTX毒素生物活性蛋白。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高产量、高纯度和高活性的MarTX毒素的制备方法。

在本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白从N端到C端具有式I所示结构：

P1-P2-P3-P4 (式I)

式中，

P1为纯化标签元件；

P2为麦芽糖结合蛋白元件(MBP)；

P3为蛋白酶识别位点元件；