[发明专利]一种日本黄姑鱼鱼肉免疫调节肽的制备方法

说明书

本发明涉及一种日本黄姑鱼鱼肉免疫调节肽的制备方法，以日本黄姑鱼肉为原料，以小鼠巨噬细胞RAW264.7相对增殖率为指标，采用响应面法优化日本黄姑鱼肉免疫活性肽的提取工艺。在单因素试验的基础上，以料液比、pH、酶解温度和酶解时间为考察因素，采用Box‑Behnken法进行四因素三水平试验设计，以日本黄姑鱼肉多肽对小鼠巨噬细胞RAW264.7相对增殖率为响应值，进行酶解工艺的条件优化。本发明为日本黄姑鱼鱼肉提取免疫活性肽奠定基础，为进一步研究日本黄姑鱼肉免疫肽的制备工艺提供参考。

技术领域

本发明涉及的是一种日本黄姑鱼鱼肉免疫调节肽的制备方法，属于免疫类生物制品技术领域。

背景技术

免疫系统对我们的生存至关重要，具有防御病原体的作用，但免疫系统易受到多种因素的影响，包括压力，不健康的生活习惯，病原体和抗原等。已发现的几种具有调节人体免疫应答的药物有环孢菌素，他克莫司，糖皮质激素，叶绿醇，马兜铃酸，白花丹素和左旋咪唑等。然而，由于这些药物的毒副作用和高成本限制了其在患者中的使用，并且大多数免疫调节药物不适用于慢性或预防性用途。研究表明，以食源性蛋白为原料，经商业化蛋白酶水解及分离纯化后得到的寡肽、多肽以及一些蛋白酶水解物混合肽在动物或细胞试验显示出显著免疫调控效果。

近年来，研究人员从海洋生物中提取生物活性肽对免疫调节功能进行了大量的研究。日本黄姑鱼鱼肉中含丰富的胶原蛋白，是提取生物活性肽的优良原料。

海洋活性肽类因其具有免疫调节、舒张血管、抗肿瘤、抗疲劳、抗氧化、抗炎及抗真菌等生理活性，成为目前海洋性功能成分的研究重点之一。酶解法是提取制备海洋活性肽的一种常用的方法，利用酶解法提取制备海洋活性肽已成为近年来研究的热点。叶盛旺等通过胃蛋白酶从青蛤中制备多肽，验证其在体内体外具有免疫调节作用。Vo Thanh-Sang等^[4]从螺旋藻中用酶解法提取并纯化了抗炎多肽。Wang Yukai等从牡蛎中提取寡肽，作用于小鼠，发现有显著的免疫作用。Ahn Chang Bum等以鲑鱼胸鳍副产物为原料，用胃蛋白酶酶解制备了抗炎多肽。Hou Hu等从鳕鱼骨架中用胰蛋白酶提取具有免疫活性的多肽。

日本黄姑鱼(Nibea japonica)，俗称黑毛鲿，隶属鲈形目、石首鱼科、黄姑鱼属，主要分布于中国东海及日本南部海。日本黄姑鱼味道鲜美，营养丰富，其鳔是名贵的中药补品。鱼皮中有丰富的胶原蛋白，Yu Fangmiao等利用胃蛋白酶提取日本黄姑鱼皮胶原蛋白并研究其理化性质。Tang Yunping等研究了日本黄姑鱼皮胶原蛋白的生物相容性。日本黄姑鱼肉中蛋白质含量较高，容易被人体消化吸收，但其作为蛋白来源用于提取制备免疫活性肽的研究鲜为报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种通过酶解获得蛋白肽，且酶解反应条件温和、反应时间短、效率高，反应过程易控制，蛋白肽得率高，对免疫调节功能作用明显的日本黄姑鱼鱼肉免疫调节肽的制备方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种日本黄姑鱼鱼肉免疫调节肽的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

a)预处理：日本黄姑鱼去除鱼皮、鱼鳍以及内脏后洗净，绞碎，绞碎后用乙醇脱脂若干次；脱脂后的日本黄姑鱼鱼肉离心，收集沉淀洗至无乙醇味后冷冻备用；

b)酶解：在步骤a)得到的日本黄姑鱼鱼肉中加入纯水与蛋白酶，酶解2-10h后灭酶活，冷却至室温后离心，得到上清液；

c)后处理：取步骤b)得到的上清液，冷冻干燥，得到日本黄姑鱼鱼肉免疫调节肽；

d)筛选：将冻干的酶解产物配成浓度为100μg/mL溶液，采用MTT法检测5组酶解产物对RAW 264.7细胞增殖的影响，并计算相对增殖率，筛选出最佳酶解的蛋白酶，采用响应面法优化日本黄姑鱼肉免疫活性肽的提取工艺。