[发明专利]一种基于RPA技术用于检测河蟹布尼亚病毒的引物及检测方法

说明书

本发明公开了一种基于RPA技术用于检测河蟹布尼亚病毒的引物及检测方法，属于水产动物病毒的分子检测技术领域，所述引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，用于检测或辅助检测河蟹布尼亚病毒。以该引物对河蟹待测样本进行检测，若RPA扩增产物含有大小为160bp的片段，则所述待测河蟹中含有了布尼亚病毒。该RPA引物特异性强，灵敏度高，检测结果准确。本发明提供了一种基于RPA技术用于检测河蟹布尼亚病毒的方法，具有操作简单，稳定性好，为有效检测和鉴定河蟹布尼亚病毒提供一种成本低、快速、特异性强的现场诊断方法。

技术领域

本发明属于水产动物病毒的分子检测技术领域，涉及到一种基于RPA技术用于检测河蟹布尼亚病毒的引物及检测方法。

背景技术

河蟹学名中华绒螯蟹，又名大闸蟹，隶属于节肢动物门、甲壳纲、绒螯蟹属，河蟹适应性强，分布较广，主要分布于我国沿海诸省各大水系，由此形成长江水系、辽河水系、瓯江水系和闽江水系4个种群。河蟹是洄游性甲壳类动物，经济价值较高，河蟹肉质细嫩，蟹黄蟹膏不仅口感鲜美而且营养丰富，历来被人们视为水产珍宝，是世界各国水产增养殖的重要对象。

近年来河蟹市场需求量日益增加，其养殖规模不断扩大，养殖环境也越来越恶劣，病害发生越来越多。河蟹已知的病毒包括：呼肠孤病毒(EsRV816，905及2012)、布尼亚病毒(EsBV)、及白斑综合症病毒(WSSV)等几类。这些病毒都具有垂直传播的特性。这些病毒在一定条件下可以使河蟹致病，甚至致死。为河蟹养殖经济带来巨大的损伤。

其中，河蟹布尼亚病毒(Bunia virus)是一类具球形、有包膜和分节段负链RNA病毒，表面有糖蛋白突起，能自然感染于河蟹等节肢动物，从而引起河蟹传染病。河蟹布尼亚病毒是河蟹颤抖病的病原之一。该病毒造成河蟹活动力下降，饮食减少，严重者可导致河蟹死亡。目前，针对该病毒尚无有效的治疗方法，病毒的早期准确检测对疾病的预防和控制尤为重要，因此建立一种简便、快速、灵敏、准确的病毒检测方法对病毒病的防控具有重要意义。

目前应用较多病毒检测方法有聚合酶链式反应(PCR)、巢式PCR和荧光定量PCR等技术。但这些方法均需要昂贵的PCR仪或特殊仪器设备和专业的试验场地，同时PCR扩增的过程，操作复杂繁琐、耗时长，时效性低，并且需要具有一定分子生物学基础及操作技术的专业人员才能完成，不能满足水产养殖现场检测诊断的需求。

重组酶介导等温扩增(Recombinase Polymerase Amlification，RPA)技术被公认是可以替代PCR的核酸检测技术。其原理是利用重组酶与引物结合形成蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。另外，RPA技术有多重工具酶匹配进行有效扩增，扩增效率远高于传统的PCR技术，所用时间更短，最短可在5min内实现。由于RPA技术具有扩增用时短、不需昂贵仪器、特异性好等特点，使其应用越来越广泛。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于RPA技术用于检测河蟹布尼亚病毒的引物及检测方法

技术方案

本发明第一个目的是提供一种基于RPA技术用于检测河蟹布尼亚病毒的引物，所述引物包括上游引物RPA ESBV-1F和下游引物RPA ESBV-1R，所述上游引物RPA ESBV-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物RPA ESBV-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明第二个目的是提供上述引物在检测或辅助检测河蟹布尼亚病毒中的应用。

本发明第三个目的是提供一种利用基于RPA试剂盒技术检测或辅助检测河蟹布尼亚病毒的RPA试剂盒，所述RPA试剂盒包括权利要求1所述的引物。

本发明第四个目的是提供一种利用基于RPA试剂盒技术检测或辅助检测河蟹布尼亚病毒的方法，具体包括以下步骤：