[发明专利]一种基于RPA技术用于检测河蟹布尼亚病毒的引物及检测方法

权利要求书

1.一种基于RPA技术用于检测河蟹布尼亚病毒的引物，其特征在于：所述引物包括上游引物RPA ESBV-1F和下游引物RPA ESBV-1R，所述上游引物RPA ESBV-1F的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述下游引物RPA ESBV-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种根据权利要求1所述引物在检测或辅助检测河蟹布尼亚病毒中的应用。

3.一种基于RPA技术检测或辅助检测河蟹布尼亚病毒的RPA试剂盒，其特征在于：所述RPA试剂盒包括权利要求1所述的引物。

4.一种基于RPA技术检测或辅助检测河蟹布尼亚病毒的方法，具体包括以下步骤：

(1)cDNA制备：从待测河蟹肝胰脏或其他河蟹组织中提取病毒RNA，然后反转录成cDNA备用；

(2)RPA扩增及琼脂糖凝胶电泳：以步骤(1)中制备的cDNA作为模板，用权利要求3所述的RPA试剂盒进行RPA扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测RPA扩增产物大小；

(3)结果判定：若所述RPA扩增产物含有大小为160bp的片段，则所述待测河蟹中含有了布尼亚病毒，若所述RPA扩增产物不含有大小为160bp的片段，则所述待测河蟹中不含有布尼亚病毒。

5.根据权利要求4所述的一种基于RPA技术检测或辅助检测河蟹布尼亚病毒的方法，其特征在于：

所述步骤(2)RPA扩增及琼脂糖凝胶电泳的具体步骤如下所示：

(1)配制47.5μl的混合反应液，包括29.5μl Rehydration Buffer,10μM的上游引物2.4μl，10μM的下游引物2.4μl，模板cDNA 1μl和dH₂O 12.5μl；

(2)混合液混匀后转移至含有冻干酶粉的反应单元管中，用移液枪混匀，使管中颗粒全部悬浮，加入280mM醋酸镁溶液2.5μl，盖上管盖，快速混匀，在39℃金属浴反应4min，4min结束后，取出，剧烈翻转8-10次，混匀，重新放入金属浴上反应40min；RPA反应结束后，向RPA扩增产物中加入50μL苯酚/氯仿(1∶1)溶液，充分混匀后，11,000×g离心3min，取上清液10μL于1.0％琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳检测电压180V，电流250A，检测时间20min，在凝胶成像系统上观察结果。