[发明专利]一种CRISPR单碱基修复系统及其应用

说明书

本发明公开了一种CRISPR单碱基修复系统，包括能表达sgRNA和Cas9的真核表达载体，以及作为供体模板的单链寡核苷酸，其中，所述单链寡核苷酸的碱基序列与以需要修复的单碱基两侧第30～60个碱基之间的碱基序列基本一致，区别在于，在所述供体模板上，与需要修复的单碱基相应的碱基为未突变野生型的碱基，以及需要修复的单碱基的一侧发生了无义突变。本发明还公开了CRISPR单碱基修复系统在制备治疗β珠蛋白基因CD17A→T点突变导致的β地中海贫血病的药物中的应用。本发明中将CRISPR/Cas表达质粒和donor二者共同转染到细胞中，在293TT细胞中特异性的诱导β17地中海贫血中基因突变位点的无痕定向改造，对开展基于单基因点突变疾病的基因编辑精准治疗，具有重要的临床应用价值。

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，尤其是一种CRISPR单碱基修复系统及其 在治疗单基因点突变导致的β17地中海贫血遗传疾病中的应用。

背景技术

β地中海贫血病(β地贫)是由于β珠蛋白基因的突变或缺失导致的构成血 红蛋白HbA(a2β2)的珠蛋白肽链合成减少或不能合成，造成a与β肽链合成 失衡所引起的一种常染色体隐性遗传病。β地贫基因常以点突变最为常见，β珠 蛋白基因的CD17(A→T)点突变是最早报道的与β地贫疾病相关的点突变之 一。

目前可通过终生输血治疗地中海贫血症，然而绝大多数患儿在积极治疗的情 况下仍在成年前死亡。另一种治疗方法则是通过骨髓或造血干细胞移植，但要找 到相匹配的异体捐赠者非常困难，且费用不菲。目前只能通过胚胎植入前行遗传 学诊断技术或通过胎儿脐血细胞基因检测技术，筛选正常的胚胎或胎儿来阻断地 贫致病基因的传播。随着基因编辑技术的出现与发展，如何利用基因编辑技术对 基因突变类型遗传性疾病进行预防与治疗是目前新兴的疾病临床治疗模式。

从2011年美国率先提出“迈向精准医学”的倡议后，中国的精准医学也不断 向前推进。“精确的基因编辑”是基因编辑技术的核心，也是精准医学的重要体现。 开展基于特异性基因突变所致疾病的基因编辑精准治疗，获得更加精准高效的 基因编辑是未来疾病治疗的创新方向。CRISPR技术自2012年面世以来，极大 地促进了基因编辑在多种疾病包括恶性肿瘤和遗传性疾病的治疗作用，获得了 广泛的临床应用，诸如此类：2016年美国国立卫生研究所批准了从癌症患者体 内提取出免疫系统的T细胞，利用CRISPR对T细胞进行基因修饰，并将基因 修饰后的T细胞输回病人体内，基因修饰后的T细胞将靶向摧毁肿瘤细胞；2018 年5月，NATURE杂志报道了通过CAR-T治疗治愈一例患者白血病的病例；在 中国，2016年10月首次批准了利用CRISPR开展人体临床试验，来治疗化疗、 放疗以及其它疗法治疗无效的转移性非小细胞肺癌患者等等。已有报道利用 CRISPR治疗地中海贫血：通过利用基因编辑工具CRISPR精确特异性修复患者 体细胞β珠蛋白基因(hemoglobin subunitbeta，HBB)缺陷基因，然后将基因 编辑与修复后的体细胞诱导成多能干细胞，最后移植入体内，从而分裂和分化 为相应有功能的红细胞，来治疗和缓解β-地中海贫血患者症状。目前，针对β 型地中海贫血的基因治疗，着手对象已从诱导型多能干细胞(iPS)和造血干细胞(HSC)过渡到人类胚胎，直接阻断该遗传性疾病的垂直传播。