[发明专利]一种高产γ-氨基丁酸的乳酸菌诱变方法及筛选方法

说明书

本发明公开了一种高产γ‑氨基丁酸的乳酸菌诱变方法及筛选方法，包括以下步骤：选取实验室保存的乳酸片球菌ZY‑6(Weissellaviridescens ZY‑6)为出发菌株，经过活化培养、菌悬液制备、诱变处理、培养得到诱变菌，再经诱变菌发酵培养、γ‑氨基丁酸产生菌初筛、高产γ‑氨基丁酸乳酸菌的复筛挑选出γ‑氨基丁酸产量较高的菌株。本发明方法简单易行，成本低，诱变株产GABA量高且稳定，是乳酸菌获得高效产GABA的一种有效方法，菌种长久保藏、应用前景广阔，而且反应条件温和，以L‑谷氨酸或L‑谷氨酸钠为唯一底物，转化液中无其他培养基成分，利用乳酸菌可能存在的谷氨酸脱羧酶，将底物L‑谷氨酸或L‑谷氨酸钠转化为γ‑氨基丁酸，通过纸层析分析转化液中是否存在GABA，提高筛选效率。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种乳酸菌的诱变，具体涉及一种高产γ-氨基丁酸的乳酸菌诱变方法及筛选方法。

背景技术

γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid，GABA)，又叫氨酪酸，是一种非蛋白质组成的天然氨基酸，为哺乳动物中枢神经系统中最重要的抑制性神经递质，具有重要的生理功能：如降血压作用、改善脑机能、延长记忆力、镇静神经、抗焦虑作用、改善肝功能、活化肾功能和降低胆固醇。GABA除具有上述的生理作用外，还有调节激素分泌，改善更年期综合症，促进酒精代谢、消臭、高效减肥、诱发人精子顶体、促进动物的抗病和生长等功能。另外，大量研究证明，GABA的缺乏将导致癫痫病的发生，因此在饮食中适当补充GABA对由于GABA的缺乏引起的癫痫病有一定预防作用。由于其特殊生理功能，GABA已经成为一种新型功能性因子，正被广泛用于食品保健、医药、化工和农业等行业，具有广阔的应用前景。

制备GABA的方法主要有化学合成法和生物合成法，其中生物合成法又包括植物富集法和微生物发酵法。生物合成法是利用生物体内的谷氨酸脱羧酶(glutamatedecarboxylase，GAD)作为催化剂，将L-谷氨酸或其钠盐α-脱羧生成GABA。相比而言，化学合成反应条件剧烈，采用的化学溶剂具有毒性和腐蚀性，副产物多，安全性差，主要应用于化工行业。生物合成法较化学合成法具有条件温和，环境污染相对较低、安全性高等优点。另外，由于微生物具有生长速度快、生长条件较简单、代谢过程特殊和分布广泛等特点，是生物酶的重要来源。因此，利用微生物生产GABA，不受资源、环境和空间的限制，具有显著的优点。

谷氨酸脱羧酶广泛分布于各种有机体活细胞，是生物催化谷氨酸脱羧生成GABA的唯一酶。而在多种细菌、真菌微生物中发现了谷氨酸脱羧酶的存在。乳酸菌被公认是一种食品安全级的微生物，研究发现乳酸菌也具有谷氨酸脱羧酶活性，可以催化GABA的合成，具有很高的潜在价值。目前已经发现多种乳酸菌具有GABA活力，但未见绿色魏斯氏菌产GABA的报道。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种高产γ-氨基丁酸的乳酸菌诱变方法。

本发明的目的之二是提供一种高产γ-氨基丁酸的乳酸菌筛选方法。

为实现上述目的，本发明提供一种高产γ-氨基丁酸的乳酸菌诱变方法，包括以下步骤：

(1)发酵液的制备：选取实验室保存的乳酸片球菌ZY-6(Weissella viridescensZY-6)作为出发菌株，该菌株已于2018年5月28日保存在中国广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60377，将该菌株接种到马铃薯或马丁氏液体培养基中活化培养2d-6d，得到发酵液；

(2)菌悬液制备：取上述发酵液10mL于三角瓶中，并加入50颗玻璃珠，震荡10min-20min，然后用无菌水按照1:10，1:100，1:1000比例，稀释成不同浓度，制得菌悬液；

(3)诱变处理：