[发明专利]一种高产γ-氨基丁酸的乳酸菌诱变方法及筛选方法

权利要求书

1.一种高产γ-氨基丁酸的乳酸菌诱变方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)发酵液的制备：选取实验室保存的乳酸片球菌ZY-6(Weissella viridescens ZY-6)作为出发菌株，该菌株已于2018年5月28日保存在中国广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60377，将该菌株接种到马铃薯或马丁氏液体培养基中活化培养2d-6d，得到发酵液；

(2)菌悬液制备：取上述发酵液10mL于三角瓶中，并加入50颗玻璃珠，震荡10min-20min，然后用无菌水按照1:10，1:100，1:1000比例，稀释成不同浓度，制得菌悬液；

(3)诱变处理：

①紫外诱变处理：不同浓度的菌悬液在红光灯下各吸5ml于9cm双碟中，放入搅拌子，于15W、距离照射菌悬液30cm的紫外灯下，分别照射0s、15s、30s、45s、60s、75s、90s，制定致死率曲线，选择致死率在70％-90％的时间诱变，制得处理液；

②处理液的分离：吸0.5ml的处理液于第1号稀释管中，得10^-1稀释菌液，如此重复6次，依次稀释到10^-6稀释菌液；

③紫外-氯化锂复合处理：将稀释到10^-6稀释菌液重复上述紫外诱变处理进行二次诱变，将二次诱变后的菌液涂布在含0.2％-0.3％的氯化锂培养基上；

(4)培养：所有涂布完成的培养基放入培养箱中在35℃-40℃条件下培养36h-72h。

2.根据权利要求1所述的高产γ-氨基丁酸的乳酸菌的诱变方法，其特征在于，步骤(3)中进行紫外照射前紫外灯先预热15-20min。

3.根据权利要求1或2所述的高产γ-氨基丁酸的乳酸菌的诱变方法，其特征在于，所述马铃薯液体培养基的组成为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15～20g和水1000mL；马丁氏液体培养基的组成为：磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、琼脂15～20g和水1000ml。

4.根据权利要求1或2所述的高产γ-氨基丁酸的乳酸菌的诱变方法，其特征在于，所述氯化锂培养基的组成为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15～20g、水1000mL和0.2g～0.3氯化锂；或者是磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、琼脂15～20g、水1000ml和0.2g～0.3氯化锂。

5.一种高产γ-氨基丁酸的乳酸菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)供试乳酸菌发酵培养：将权利要求1或2所述的方法诱变后的供试乳酸菌菌种接种于MRS培养基中，在41℃静置厌氧培养24h，以3％的接种量接种到含有1％L-谷氨酸钠的GYP发酵培养基中，静置厌氧培养48h，取发酵液进行离心，转速2000r/min、离心时间10min，取上清液；

(2)γ-氨基丁酸产生菌初步筛选：吸取上清液2μL，点样于G型薄层硅胶板上，点样线距底边2cm，点样点间距1.5cm，以展开剂系统：正丁醇：乙酸：水＝5：3：2，采用4g/L茚三酮作为显色剂，当层析到达硅胶板上端1-2cm时结束层析，在65℃条件下烘干滤纸，以是否存在γ-氨基丁酸对应的斑点作为检测指标，同时以1％的γ-氨基丁酸和L-谷氨酸钠标准样品做为对照检测，筛选出能够合成γ-氨基丁酸的乳酸菌；

(3)高产γ-氨基丁酸乳酸菌的复筛：将初筛出的乳酸菌菌株接种到含有150mL无菌种子培养基的三角瓶中，41℃静置培养24h后，以5％的接种量接入含有150mL无菌发酵培养基的三角瓶中，每瓶种子接三瓶发酵液进行对照，41℃静置培养24h，采用液相色谱法测定发酵液中GABA的含量，挑选出γ-氨基丁酸产量较高的菌株。

6.根据权利要求5所述的高产γ-氨基丁酸的乳酸菌的筛选方法，其特征在于，所述无菌种子培养基的组成为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼脂1.5g和纯化水1000ml。