[发明专利]一种CHO细胞基因组内NW_003613638-1稳定表达蛋白质的应用

说明书

本发明公开了一种CHO细胞基因组内NW_003613638‑1稳定表达蛋白质的应用，所述CHO细胞基因组内用于稳定表达蛋白质的位点位于CHO细胞基因NW_003613638.1的第1969647碱基处；所述位点附近范1969591‑1969721围内可被CRISPR/Cas9技术识别的5'NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG3'为靶序列。本发明申请在CHO细胞基因组内的固定位置，导入不同蛋白质基因，并进行稳定表达。

技术领域

本发明涉及基因技术领域，尤其是涉及一种用于稳定表达蛋白质的CHO细胞重组基因。

背景技术

中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary cell,CHO)作为生物制药领域的主力细胞系，已经被开发出许多不同种类的CHO细胞系，包括可以用来扩大基因拷贝数的细胞系。然而，转基因拷贝数的增多与目的蛋白质产率提高并不是明确的正相关关系。且即使蛋白质表达增多，多数CHO细胞的表达水平不稳定。当前普遍使用的构建稳定转染细胞的方法耗时耗力，主要是因为需要重复大量的单克隆筛选过程，所以当前在细胞系构建领域普遍期待可以开发出一种能在短时间内，获得高表达及稳定表达的细胞的方法，并且能够确保构建出来的重组细胞系与传统方法相比，有相同的质量水平，以确保监管机构的批准。

传统构建外源蛋白质表达细胞系的方法是通过外源基因随机整合到细胞基因组上，再经过系列的高表达单克隆细胞筛选，获得外源蛋白质高表达细胞系。由于位点效应差异的多样性，随机整合产生的重组细胞表达水平各异，因此需要后期花费很长的时间和很多的步骤，用于挑选高表达单克隆细胞。通过随机整合获得的单克隆细胞无法保证多肽/蛋白质在细胞传代中稳定表达，每进行一次重组细胞构建均需要反复进行单克隆筛选，增加了生物制药的研发成本。

位点效应妨碍着传统随机整合构建重组细胞系的效率，反复的高表达单克隆筛选费时费力，且成本昂贵。如何克服位点效应，利用定点整合技术，快速高效地获得稳定表达单克隆细胞已经在学术界被讨论了多年，一直未有突破性进展。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明申请人提供了一种CHO细胞基因组内NW_003613638-1稳定表达蛋白质的应用。本发明申请在CHO细胞基因组内的固定位置，导入不同蛋白质基因，并进行稳定表达；此外在实现该定点整合的过程中，无需多次挑选单克隆以获得更高的表达细胞株，节省了大量的时间。

本发明的技术方案如下：

一种CHO细胞基因组内某位点稳定表达蛋白质的应用，所述CHO细胞基因组内用于稳定表达蛋白质的位点位于CHO细胞基因NW_003613638.1的第1969647碱基处；

所述位点附近1969591-1969721范围内可被CRISPR/Cas9技术识别的5'NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG3'为靶序列。

所述蛋白质为分子量小于160KDa的蛋白质。

所述蛋白质为红色荧光蛋白、多肽、功能性蛋白质、抗体、融合蛋白质中的一种。

所述靶序列为CHO细胞基因NW_003613638.1的第1969647碱基处附近第1969633-1969655碱基处。

进一步所述靶序列为5’-CCATGAGGAAAACTTTTTGAGGG-3’。

所述靶序列为5’-ATTTATATTCAGTATACATTTGG-3’。

所述靶序列为5’-TTTATATTCAGTATACATTTGGG-3’。

所述靶序列为5’-GTGTATCTTCGAACCAAAACTGG-3’。

所述靶序列为5’-TGTATCTTCGAACCAAAACTGGG-3’。