[发明专利]一种罗非鱼鱼鳞免疫调节肽的制备方法

说明书

本发明属于免疫调节肽技术领域。本发明公开了一种罗非鱼鱼鳞免疫调节肽的制备方法，其包括鱼鳞预处理、鱼鳞粉碎、鱼鳞脱钙、鱼鳞脱脂、鱼鳞酶解和后处理等步骤。本发明通过对加工过程中废弃的罗非鱼鱼鳞进行深加工高效地获得了一种具有显著免疫调控效果的免疫调节肽，其能够适用于慢性或预防性用途，也能够适用于广大人群，能够降低用药成本。

技术领域

本发明涉及免疫调节肽技术领域，尤其是涉及一种罗非鱼鱼鳞免疫调节肽的制备方法。

背景技术

免疫系统对我们的生存至关重要，具有防御病原体的作用，但免疫系统易受到多种因素的影响，包括压力，不健康的生活习惯，病原体和抗原等。已发现的几种具有调节人体免疫应答的药物有环孢菌素，他克莫司，糖皮质激素，叶绿醇，马兜铃酸，白花丹素和左旋咪唑等。然而，由于这些药物的毒副作用和高成本限制了其在患者中的使用，并且大多数免疫调节药物不适用于慢性或预防性用途。研究表明，以食源性蛋白为原料，经商业化蛋白酶水解及分离纯化后得到的寡肽、多肽以及一些蛋白酶水解物混合肽在动物或细胞试验显示出显著免疫调控效果。罗非鱼加工过程中丟弃的鱼鳞中含丰富的胶原蛋白，是提取生物活性肽的优良原料。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种利用罗非鱼鱼鳞制备免疫调节肽的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种罗非鱼鱼鳞免疫调节肽的制备方法，包括以下步骤：

a）鱼鳞预处理：取罗非鱼鱼鳞依次用无水乙醇和水清洗，然后在0.1～0.15mol/L的盐酸中浸泡1～2小时，之后沥干；

b）鱼鳞粉碎：将经上述处理的罗非鱼鱼鳞用水清洗至中性，然后粉碎至的鱼鳞浆；

c）鱼鳞脱钙：向鱼鳞浆中加入0.5～1.5mol/L的柠檬酸溶液并使液面没过鱼鳞浆，充分搅拌处理4～6小时，然后过滤分离得到固含物，并将固含物用水清洗1～3次后沥干，然后向固含物中加入固含物重量1～1.5倍0.15～0.20mol/L的EDTA溶液，在35～40℃下搅拌处理1～2小时，之后过滤并清洗沥干制得脱钙鱼鳞；

d）鱼鳞脱脂：向脱钙鱼鳞中加入脱钙鱼鳞重量0.5～0.8倍异丙醇，搅拌脱脂处理20～24小时，然后用水清洗至无异丙醇味，接着用1～2mol/L的氢氧化钠溶液浸泡20～24小时，用水清洗至中性后制得预处理鱼鳞；

e）鱼鳞酶解：按蛋白酶的量为1500～2000U/g，料液比为1：（10～15）配制鱼鳞酶解液，在40～50℃下酶解5～7小时，制得酶解鱼鳞；

f）后处理：将酶解鱼鳞在沸水中灭酶10～15min，冷却至室温后，在3～5℃，10000～14000rpm条件下离心处理15～20分钟，收集上清液，冷冻干燥制得罗非鱼鱼鳞免疫调节肽。

鱼鳞中含有大量的钙质、重金属和灰分，这些杂质的存在会大大的影响酶解过程及酶解后产物的品质，因此在酶解前需要将这些杂质除去，但是在除去这些杂质的同时也要保护其中的蛋白质不会过多的流失。现有类似领域中，脱钙常采用酸法进行，但是酸法脱钙往往会造成蛋白质的大量流失，因此本发明中采用柠檬酸和EDTA组合的方式进行脱钙，利用这种方式在脱钙的同时也能实现灰分的去除，此外还可以减少EDTA的使用，降低处理成本。

虽然在脱钙过程中，柠檬酸和EDTA的浓度和添加量越高越有利于脱钙脱灰分的效果，但是在浓度和添加了增加到本发明中的范围后，效果增加不明显，因此为了结果成本实现最高效的脱钙，将柠檬酸的浓度设定为最高不超过1.5mol/L，EDTA溶液的浓度不超过0.20mol/L，并且对添加量进行了限定。

作为优选，步骤d）鱼鳞脱脂过程为，向脱钙鱼鳞中加入脱钙鱼鳞重量0.7倍异丙醇，搅拌脱脂处理24小时，然后用水清洗至无异丙醇味，接着用1.5mol/L的氢氧化钠溶液浸泡24小时，用水清洗至中性后制得预处理鱼鳞。