[发明专利]一种Nucyep的编码基因、重组表达载体、重组工程菌及其制备方法和应用

说明书

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种Nucyep的编码基因、重组表达载体、重组工程菌及其制备方法和应用。该重组Nucyep的编码基因的核苷酸序列如Seq ID No.2所示，或为与核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的基因具有90％以上同源性的基因。将所述Nucyep的编码基因与pET‑24a(+)质粒重组构成重组表达载体，并将该重组表达载体转化入大肠杆菌Rosseta(DE3)构成重组工程菌。本发明所述重组工程菌的优点在于，优化了Nucyep的编码基因序列，使得该重组工程菌，在乳糖诱导下，仅需几个小时即可产生大量目的蛋白。表达产物为包涵体，避免了可溶性核酸酶对宿主菌的毒性作用。且本发明提供了Nucyep包涵体的复性和纯化方法，效率高，流程简单，易于操作，更加适用于Nucyep的工业生产和推广。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种Nucyep的编码基因、重组表达载体、重组工程菌及其制备方法和应用。

背景技术

核酸酶是以核酸为底物，催化磷酸二酯键水解的一类酶。一般核酸酶可以分为DNA酶、RNA酶和非特异性核酸酶三类。其中非特异性核酸酶的专一性较低，能非特异性地降解几乎所有形式的核酸，包括单链、双链、线状、环状和超螺旋形式的DNA和RNA，且对核酸的序列没有要求。非特异核酸酶广泛存在于病毒，细菌，真菌和动物细胞等多种生物中。非特异核酸酶在很多生化过程中起重要作用，包括DNA的复制和修复；DNA/RNA的重组、成熟和编辑；宿主抵抗外来核酸分子等等。非特异性核酸酶在工业上主要用于生物制品中外源核酸的去除，提高安全性。同时，非特异核酸酶还能应用于新型生物消毒剂的研制，它能裂解细菌和病毒的核酸物质，从而达到消毒杀菌的目的。相比化学消毒剂，非特异核酸酶是一种理想的绿色环保消毒制剂，不污染环境，对机体无任何毒副作用。到目前为止，已报道有多种非特异性核酸酶，如牛胰岛DNase I，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)核酸酶和粘质沙雷氏菌(Serratia marcescen)胞外核酸酶等。迄今，研究最多的非特异核酸酶是灵杆菌核酸酶。目前灵杆菌核酸酶已有商业化产品推出，商品名叫Benzonase，它作为一种工具在工业生产中被用于去除生物制品中的核酸污染。

Benzonase应用的温度范围+5℃-+40℃，然而在生物技术药物的研究和生产过程中，很多时候会用到高温处理样品，这样的条件下想要去除核酸干扰，Benzonase无法满足需求，迫切需要开发出一种新型的能在更高温度下发挥活性的核酸酶。2013年，中国科学家团队在小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica subsp.palearctica)中发现了一种新型耐高温的非特异性核酸酶(Nucyep)。该酶由283个氨基酸组成，分子量大小30.7KDa，能适应宽泛的pH变化范围(pH3.6～9.9)，有极好的耐热性能，能在0～100摄氏度发挥作用。目前已有报道的Nucyep的基因工程菌，采用来源菌株的基因序列进行构建，使用IPTG作为诱导剂，诱导时间长达20几个小时，表达效率低，产品收率低，不适合大规模的工业化生产。因此，急需开发一种适用于大规模生产该种耐热非特异性核酸酶的新方法。

发明内容

Yersinia enterocolitica subsp.palearctica来源的耐热非特异核酸酶(Nucyep)酶具有非特异性降解核酸的能力，也具有良好的耐热性。本发明的目的是为了提高Nucyep的生产水平，缩短诱导时间，增加达标效率和产品收率。本发明优化了Nucyep的编码基因序列，构建了重组表达载体和基因重组工程菌，该重组工程菌可高效表达目的产物。本发明还提供了Nucyep的制备方法，该制备方法包括Nucyep的复性和纯化方法，该方法高效，简单，更加适用于大规模生产。

本发明所采用的技术方案为：

本发明涉及一种来源于Yersinia enterocolitica subsp.palearctica的耐热非特异核酸酶(Nucyep)，具体所涉的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。