[发明专利]检测乙肝病毒rcDNA和/或cccDNA的寡核苷酸组合物、试剂盒和方法及用途

说明书

本发明公开用于检测乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)松弛环状DNA(relaxed circular DNA,rcDNA)和/或共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的寡核苷酸组合物、试剂盒和方法及用途。其中寡核苷酸组合物包括第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，或者与第一寡核苷酸的序列互补的寡核苷酸和与第二寡核苷酸的序列互补的寡核苷酸；第一寡核苷酸特异性结合至第一序列的至少一部分连续序列，第二寡核苷酸特异性结合至第二序列的至少一部分连续序列，且两个连续序列之间的距离为30‑350nt，第一序列为含有cccDNA或rcDNA的跨缺口区的HBV直接重复(direct repeat,DR)序列的DR2‑DR1之间的序列，第二序列为DR1的第五个碱基之后的序列。本发明可以有效检测HBV rcDNA和/或cccDNA的水平，而不受整合HBV DNA的影响。

技术领域

本发明涉及乙型肝炎病毒的检测，具体地涉及用于检测乙型肝炎病毒rcDNA和/或cccDNA的寡核苷酸组合物、试剂盒和方法。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染呈世界性流行，不同地区HBV感染的流行强度差异很大。根据病毒基因组序列相似度，HBV至少分为10个基因型(A-J)。据世界卫生组织报道，全球约20亿人曾感染HBV，其中2.4亿人为慢性HBV感染者。我国属于中高流行区，HBV感染以B型和C型为主。在2006年全国乙型肝炎血清流行病学调查中，我国1-59岁一般人群HBsAg携带率为7.18％。据此推算，我国慢性HBV感染者约为9300万人，其中慢性乙型肝炎(慢乙肝)患者约2000万例。HBV持续感染引起慢性乙型肝炎(CHB)，也是肝硬化和肝细胞癌(HCC)发生发展的重要因素。在我国，一半以上的肝硬化和HCC患者由HBV引起。

HBV属嗜肝DNA病毒科，是已知最小的DNA病毒之一，基因组为全长约3.2kb(3182-3248，不同基因型病毒基因组序列长度有所不同)的不完全闭合环形DNA(rcDNA)，双链长度不对称，单链部分占全长的15-50％。HBV子代病毒复制存在以前基因组 RNA(pgRNA)为模板逆转录合成子代病毒DNA的过程，该过程发生在P蛋白与pgRNA 结合并招募核心抗原形成的核衣壳内。跳转后的逆转录起始于pgRNA的3’末端的DR1 区并沿pgRNA向其5’端逐步延伸，同时模板pgRNA在P蛋白的RNase H作用下被分段降解。HBV负链合成完成后正链合成开始，正链DNA以新合成负链DNA为模板，其引物为5’端残余的pgRNA，该引物跳转至负链DR2区并向负链5’端延伸至末尾，然后再次发生跳转，至负链3’末端继续延伸合成正链。由于很快获得包膜并释放出细胞，子代病毒的正链不完整，长度为负链全长的15-50％。子代病毒所含的病毒核酸为不完全闭合环形的松弛型rcDNA，病毒感染后rcDNA进入细胞核经加工后形成cccDNA，HBV cccDNA是病毒各种转录本转录的模板，由于其以微小染色体形式存在于细胞核中，是 HBV持续存在难以清除以及发生再感染的遗传学因素。HBV结构的示意图见图1。