[发明专利]适用于曼氏无针乌贼缝隙连接的基因标记方法

说明书

本发明提供适用于曼氏无针乌贼缝隙连接的基因标记方法，属于基因标记技术领域，采用实时荧光定量PCR检测曼氏无针乌贼缝隙连接的基因；采用原位杂交检测曼氏无针乌贼缝隙连接的基因的表达分布；基因为缝隙连接的标记蛋白Innexin。本发明采用实时荧光定量PCR和原位杂交方法检测曼氏无针乌贼缝隙连接标记蛋白Innexin基因的表达变化，准确地确定Innexin基因变化的准确位置，所用原位杂交能增加探针与靶核酸结合的机会，阻止染色体收缩，提高杂交信号，结果的可靠性高。

技术领域

本发明属于基因标记技术领域，具体涉及适用于曼氏无针乌贼缝隙连接的基因标记方法。

背景技术

头足类属于软体动物，是海洋生态系统中的重要组成部分，同时对海洋生态平衡有着不可或缺的作用。乌贼属于软体动物门(Mollusca)、头足纲(Cephalopoda)，广泛分布在各个海域，在生物系统演化中占有重要的地位。其肉质鲜美可口，具有很好的营养价值，蛋白含量极高。除了可以食用以外，还有很高的药用价值，墨囊可以促进血液凝固并且具有抑菌功能，海螵蛸可以药用，耳石可用来分析物种的年龄和海洋环境的时空变化。另外，乌贼还是海洋生态系统中十分重要的生物因子，在生态系统的食物链中扮演着十分重要的角色，对维持海洋生态系的生态平衡起着非常重要的作用。近年来，乌贼作为重要的经济头足类在海洋生态系统中起着关键的作用。由于过度捕捞与环境变化，其资源量一度遭到极大破坏，其自然资源明显衰退，产量急剧下降，渔汛消失，临近濒危。自上个世纪80年代以来，得益于人工繁育和养成技术的突破，其资源量正处于逐步恢复中。

多细胞生物最大的特点就是细胞能彼此沟通交流，以此形成统一的整体。实现多细胞生物内在统一的交流形式主要有细胞外通讯、细胞间通讯、细胞内通讯这三种通讯网络。细胞外的信号(例如，激素)触发细胞内信使分子(例如，信号转导因子)，进而又影响细胞间通讯。缝隙连接(gap junction，GJ)是细胞连接的一种，广泛地存在于各种动物组织中。且分布广泛，尤其在心脏和脑组织中承担着重要的作用。在结构上缝隙连接是由相邻细胞上两个连接子互相锚定形成，两个半通道开放形成直径约为1.5nm的细胞间通道，其主要可以允许多种小分子、离子和电信号直接通过，负责细胞间电流传导、化学递质(如第二信使分子cAMP、IP3、Ca²⁺等)及小分子物质(分子量<1.5kDa的小肽、氨基酸、核酸、ATP、糖类等)的转运，调控细胞的增殖、分化、代谢等过程，对维持机体的内环境稳定和生长发育具有重要意义。从功能上来讲，缝隙连接是一种动态结构，通道的开放和关闭由多种因素调节，其中包括：细胞内pH、Ca²⁺浓度和细胞膜电位等；并且其有多种功能，与细胞的分化和代谢、营养物质传递、离子平衡调节、细胞间物质交换的代谢耦联和电耦联等有密切关系。近年来，随着对GJ研究的深入，研究者们不止关注于GJ的作用，更加关注了其在未形成GJ之前，普遍存在的半通道的功能和作用。而曼氏无针乌贼缝隙连接蛋白的表达异常及分布模式的改变将影响GJ通道的通透性及数量，进而影响曼氏无针乌贼的生长、发育等各项生理过程。因此，研究适用于曼氏无针乌贼缝隙连接的基因标记方法对曼氏无针乌贼的养殖具有重要的意义，同时填补了该物种中缝隙连接标记领域的技术空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用实时荧光定量PCR和原位杂交方法检测曼氏无针乌贼缝隙连接标记蛋白Innexin基因的表达变化及适用于曼氏无针乌贼缝隙连接的基因标记方法，准确地确定Innexin基因变化的准确位置，所用原位杂交方法能增加探针与靶核酸结合的机会，阻止染色体收缩，提高杂交信号，结果的可靠性高。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

适用于曼氏无针乌贼缝隙连接的基因标记方法，包括，

采用实时荧光定量PCR检测所述曼氏无针乌贼缝隙连接的基因表达变化；

采用原位杂交检测所述曼氏无针乌贼缝隙连接的基因的表达分布；