[发明专利]适用于曼氏无针乌贼缝隙连接的基因标记方法

权利要求书

1.适用于曼氏无针乌贼缝隙连接的基因标记方法，其特征在于：包括，

采用实时荧光定量PCR检测所述曼氏无针乌贼缝隙连接的基因表达变化；

采用原位杂交检测所述曼氏无针乌贼缝隙连接的基因的表达分布；

所述基因为缝隙连接的标记蛋白Innexin。

2.根据权利要求1所述的适用于曼氏无针乌贼缝隙连接的基因标记方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR检测包括如下步骤：

1)提取曼氏无针乌贼基因组总RNA，反转录合成cDNA；

2)利用引物对cDNA进行实时荧光定量PCR，检测；

所述实时荧光定量PCR引物为：5’-TATGCGAGACGTGGTCCCTA-3’；5’-ACCTGAAGCGCCACTAAACA-3’。

3.根据权利要求1或2所述的适用于曼氏无针乌贼缝隙连接的基因标记方法，其特征在于：所述PCR扩增片段大小为148bp；所述扩增序列如SEQ ID NO:3所示。

4.根据权利要求1或2所述的适用于曼氏无针乌贼缝隙连接的基因标记方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR扩增采用SYBR Green染料法。

5.根据权利要求1或2所述的适用于曼氏无针乌贼缝隙连接的基因标记方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR扩增反应体系为20μL：7.6μL ddH2O、0.4μL 20μM ForwardPrimer、0.4μL 20μM Reverse Primer、10μL 2×SYBR Premix Ex Taq、1.6μL cDNA模板。

6.根据权利要求1或2所述的适用于曼氏无针乌贼缝隙连接的基因标记方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR扩增反应程序选择两步法：

7.根据权利要求1所述的适用于曼氏无针乌贼缝隙连接的基因标记方法，其特征在于：所述原位杂交包括：组织切片复水、固定、消化、预杂交和杂交、杂交后洗涤、封闭、抗体、洗涤、孵育、洗涤、封闭、抗体、洗涤、染细胞核、显色、封片后观察拍照，所述固定步骤为：将复水后的组织切片浸入含有0.01％苏氨酸的4％PFA-PBS溶液中，室温固定15min，然后用1×PBST溶液洗涤3次，每次5min；所述苏氨酸中L-苏氨酸和D-苏氨酸的比例为100:2.8-4.2。

8.根据权利要求7所述的适用于曼氏无针乌贼缝隙连接的基因标记方法，其特征在于：所述消化步骤为：将固定后的组织切片置于含10μg/ml蛋白酶K和0.8μg/ml水杨酸的溶液中，消化10min。

9.根据权利要求1或7所述的适用于曼氏无针乌贼缝隙连接的基因标记方法，其特征在于：所述原位杂交用正义和反义探针的序列为：5’-GTCCGGCCGAATTCACATCA-3’；5’-CAGGTTGATGGGCAGGACAC-3’。

10.根据权利要求1或7所述的适用于曼氏无针乌贼缝隙连接的基因标记方法，其特征在于：所述原位杂交扩增片段大小为683bp，所述扩增序列SEQ ID NO:6所示。