[发明专利]番茄晚疫病抗病基因Ph-3的四重SNP分子标记物及开发方法在审
| 申请号： | 201811222440.6 | 申请日： | 2018-10-19 |
| 公开（公告）号： | CN109182584A | 公开（公告）日： | 2019-01-11 |
| 发明（设计）人： | 叶志彪;任志勇;游泽爽;张俊红;张余洋;欧阳波;王涛涛;李汉霞 | 申请（专利权）人： | 华中农业大学 |
| 主分类号： | C12Q1/6895 | 分类号： | C12Q1/6895;C12N15/11 |
| 代理公司： | 北京金智普华知识产权代理有限公司 11401 | 代理人： | 杨采良 |
| 地址： | 430070*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 番茄晚疫病 抗病基因 一对引物 分子标记辅助育种 基因工程技术 基因标记 基因序列 两对引物 凝胶电泳 育种效率 一次PCR 基因型 假阳性 耗材 开发 酶切 抗病 节约 | ||
1.一种番茄晚疫病抗病基因Ph-3的四重SNP分子标记物，其特征在于，所述番茄晚疫病抗病基因Ph-3的四重SNP分子标记物为两对引物，其中一对引物的序列为SEQ ID NO：1、SEQID NO：2；另一对引物的序列为SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4。
2.一种如权利要求1所述番茄晚疫病抗病基因Ph-3的四重SNP分子标记物的开发方法，其特征在于，所述开发方法包括：
根据找到的4个多碱基突变位点设计引物，引物的设计遵循AS-PCR错配碱基引入的设计方法；在正向引物3’末端前一个碱基引入错配，将T换成C；其中一对引物的正反向引物的3’末端均与感病SNP位点匹配，得到感病引物Ph-3-GL-S；
另一对引物的正反向引物的3’末端均与抗病SNP位点匹配，得到抗病引物Ph-3-GL-R；
将设计好的感病引物Ph-3-GL-S、抗病引物Ph-3-GL-R进行合成，得到：
正向引物Ph-3-GL-R-F:GCTACCTTAATTATTTACAATTTTCCT；
反向引物Ph-3-GL-R-R:TTGTGAAACAGAAAAGGTAAATATCA；
正向引物Ph-3-GL-S-F:CGAAATAATGATGTAGGCAGATACACA；
反向引物Ph-3-GL-S-R:GTTGAGAAAATAGGCAAGTATCATC。
3.如权利要求2所述的开发方法，其特征在于，选取的两对引物之间在全基因组上有一定的物理距离；
感病引物Ph-3-GL-S扩增出设计长度条带或非设计条带；对扩增出来的非设计条带进行测序；扩增出的非设计条带中Ph-3基因能代表易感等位基因；
抗病引物Ph-3-GL-R在抗病材料中扩增出特异性条带。
4.如权利要求2所述的开发方法，其特征在于，找到的4个多碱基突变位点设计引物前，需进行：
搜集不同基因型相关核苷酸序列信息,从数据库中找到LA1589和Heinz1706的Ph-3对应的感病序列；
将Ph-3抗病序列和LA1589和heinz1706进行多重比对；找到4个核苷酸多态性在LA1589、Heinz1706和Ph-3以及它的同源序列中具有高度可辨性的位点。
5.如权利要求2所述的开发方法，其特征在于，得到四个引物序列后，需进行：PCR扩增与电泳检测：
PCR反应体系：总体积20μL；10X Easy Taq buffer 2.0μL，浓度10mM dNTP 0.4μL，浓度100μM P h-3-GL-S正反引物各0.09μL，浓度100μM Ph-3-GL-R正反引物100μM各0.04μL，DNA模板2μL，Easy Taq酶0.2μL，ddH2O 15.1μL；
PCR反应程序：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，进行35个循环，72℃延伸5min，4℃保存10min；
凝胶电泳检测：PCR产物用1.5％琼脂糖在120-130V电压条件下电泳15-20min，结果在凝胶成像系统上显示。
6.一种四重SNP分子标记物在检测番茄晚疫病抗病基因Ph-3中的应用。
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