[发明专利]一种DNA-Maker的简易制备方法

说明书

本发明公开了一种DNA‑Maker的简易制备方法，其步骤为：将p12S‑MK、p12F‑MK两种质粒用EcoR Ⅰ限制性内切酶进行酶切，对酶切产物进行纯化回收后，加储存液、Loading buffer混合即可。本方法稳定性高，可以确保批次之间的重复性生产，从而实现大规模生产，生产过程简单，前期载体构建好之后，后期DNA‑Maker生产成本很低，所制备的DNA‑Maker条带清晰、分布均匀并且质量稳定可长期存放。此外本发明对酶切体系及时间进行了优化，极大的提高了酶切效率，缩短了制备时间。

技术领域

本发明属于基因工程与分子生物学技术领域，具体地说，涉及一种DNA-Maker的简易制备方法。

背景技术

自20世纪50年代分子生物学诞生，一直到20世纪70年代基因工程技术出现以来，分子生物学相关技术发展迅速，各种新技术、新方法不断涌现，特别是基因组时代以及后基因组时代高通量手段的出现如基因芯片、SAGE、微卫星DNA、AFLPs、SNPs和RAPDs、基因分型和DNA指纹研究等的应用和开发使得分子生物学领域发生着翻天覆地的变化，且在生命科学、医学等学科得到了广泛应用。

在DNA的体外操作中，涉及到DNA分子的扩增、纯化、切割、连接等许多过程，其中，最基础而且应用非常广泛的一项操作是DNA扩增和电泳。而DNA分子量标准是指一组分子量已知的DNA分子的混合物，电泳后按照其分子量的大小和迁移率的不同，在凝胶上形成一个DNA片段分布的梯度(ladder)，用以指示电泳过程中未知DNA样品的分子量。

DNA-Maker的应用非常广泛，是分子生物学实验室的常用试剂。在DNA-Maker的制备上，目前主要有两种方法：酶切法和PCR法。尽管实现DNA-Maker的原理非常简单，但要制作低成本高质量的DNA-Maker还是有相当的难度。目前，许多生物公司也为此开发了多种针对不同应用的，具有不同分子量范围的DNA-Maker产品。

PCR法是根据特定的模板设计特定的引物扩增出一系列不同大小的DNA片段，通过纯化、定量和组合即形成了DNA-Maker。该方法的优点是操作简单、制作方便，各条带的大小控制方便，不同大小的条带可以灵活的组合成不同的DNA-Maker。但其成本较高，长片段扩增困难或效率不高，条带不够锐利，条带之间的亮度难以完全一致，重复性差，稳定性不高，不易长时期保存，且保存环境在-20℃，不能保存在室温条件下，不便于使用。

酶切法分为以天然来源的基因组DNA的限制性酶切和基于人工构建载体的限制性酶切。天然来源的基因组DNA酶切是指分离某种来源固定、背景信息清晰的基因组DNA分子，用一种或几种限制性内切酶进行消化。从而产生一系列DNA片段组合。用这种方法生产DNA-Maker制作方便，在DNA来源方便的情况下，成本也比较低。但其缺点也是显而易见的，即条带距离不均匀、条带的分子量未能是整数、条带亮度严重不均一等。为此，随着基因工程技术的发展，人们想到用人工构建的DNA分子(比如质粒)进行限制性酶切来制备DNA-Maker。通过一次性将所需要的片段以设计好的酶切方式连接到载体中，通过发酵培养和质粒DNA提取，适当酶切后既可获得大量目标DNA片段。这种方法的优势在于可以通过大肠杆菌的培养获得大量廉价的质粒DNA，通过酶切方法获得的片段电泳时条带锐利，生产重复性高，稳定性高，可长期保存在室温状态，一旦质粒构建好，后续生产成本低。

酶切的方法又分为部分酶切和完全酶切。部分酶切是将具有某种单位长度而且带有设计好的酶切位点的片段顺序连接到载体中，通过控制酶的活性，温度和反应时间等酶切条件，实现载体的部分酶切，酶切产物将是质粒上该单位长度的倍数的片段。该方法是用于以单位长度递增的DNA-Maker的制备，其优点是制备方便，条带分布均匀，但其缺点是部分酶切的程度难以掌握，条带亮度与酶切的完全程度相关。

完全酶切是将设计好的一组不同大小的DNA片段克隆到特定的载体中，经过大肠杆菌扩增后，将纯化得到的质粒DNA通过完全酶切，获得相应大小的DNA片段。该方法制备的DNA-Maker质量较好。