[发明专利]一种耐热柠檬酸合酶的基因、含有该基因的工程菌及其表达方法

说明书

本发明公开了一种耐热柠檬酸合酶的基因、含有该基因的工程菌及其表达方法，属于基因工程技术领域，本发明耐热柠檬酸合酶的基因以鱼腥藻PCC 7120基因组为模板，运用PCR扩增技术克降得到，基因工程菌由含柠檬酸合酶基因的重组表达质粒经在大肠杆菌宿主菌中转化而得，并经过卡那霉素抗性筛选和测序验证，制备的柠檬酸合酶的基因工程菌，具有耐热且酶活高的特性，为其更好的应用于柠檬酸的工业生产提供了一定的基础，耐热且酶活高的特性使其可以更好的节约生产成本。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种耐热柠檬酸合酶的基因、含有该基因的工程菌及其表达方法。

背景技术

柠檬酸合酶(citrate synthase,CS,EC 4.1.3.7)几乎存在于所有的生物体中，是细胞内多种重要代谢途径的关键限速酶及代谢变化的标志酶。在TCA循环中，柠檬酸合酶可催化草酰乙酸和乙酰辅酶A之间的缩合反应生成柠檬酸和辅酶A。柠檬酸是一种非常重要的有机酸，被誉为第一大有机酸，被普遍应用于食品、环保、化工、纺织和制药以及畜牧业等行业中，需求量也逐年增加。我国是世界最大的柠檬酸生产国，产能占世界的70％以上，产量占世界的65％左右。TCA循环是柠檬酸合成的主要途径，因为TCA循环对于柠檬酸合成来说非常重要，而柠檬酸合酶是TCA循环入口的关键酶。

柠檬酸生成的柠檬酸合酶最适发酵温度较高，发酵过程中需要大量冷却水对发酵罐进行降温来维持正常的发酵温度，不仅耗能大，并且目前采用的柠檬酸合酶耐温性能也难以达到，造成制造成本高、产量低、安全性差，不利于大规模的工业生产。

发明内容

根据以上现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提出一种耐热柠檬酸合酶的基因、含有该基因的工程菌及其表达方法，以解决背景技术中部分或全部不足。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种耐热柠檬酸合酶的基因，该耐热柠檬酸合酶的基因具有SEQ ID NO.1的碱基序列。

一种耐热柠檬酸合酶的基因工程菌，该工程菌构建方法包括引物设计、构建重组表达质粒和宿主菌转化，具体步骤如下：

1)引物设计：根据鱼腥藻PCC7120柠檬酸合酶基因(gltA)的基因序列设计出引物；

2)构建重组表达质粒：以鱼腥藻PCC 7120全基因组为模板，利用PCR扩增技术，得到含Nde I和Xho I酶切位点的目的基因片段，将目的基因片段与载体pET-28b同时双酶切后通过T4 DNA连接酶连接，得到重组表达质粒pET-28b-gltA。

3)宿主菌转化：将重组质粒pET-28b-gltA转化到宿主菌感受态细胞中，经过抗性筛选后，获得表达耐热型柠檬酸合酶的基因工程菌。

优选的，所述引物为包含一个Nde I位点的正向引物gltAF和包含一个Xho I位点的反向引物gltAR，其中，正向引物的序列gltAF:5′-AAATGTGCATATGATGGTGTGCGAATACAAGCCTG-3′，反向引物gltAR：5′-AGCCGCTCGAGTTATTCCCCAGCTTTTAACGTTGGTCAA-3′。

优选的，所述宿主菌为大肠杆菌(E.coli Rosetta(DE3))。

优选的，所述抗性筛选的试剂为卡那霉素和氯霉素。

一种表达耐热柠檬酸合酶的基因工程菌的方法，具体步骤如下：将基因工程菌先进行过夜培养，取培养菌液进行二次培养，然后再进行诱导培养，离心分离，得到菌体，向菌体中加入缓冲液，超声破碎，离心，上清液即为粗酶液，并采用亲和层析法纯化粗酶液，得纯化目标蛋白。

优选的，所述过夜培养和二次培养的培养基均为含卡那霉素30μg/mL和氯霉素30μg/mL的LB液体培养基，培养条件均为转速200-225rpm，温度33-39℃。