[发明专利]一种耐热柠檬酸合酶的基因、含有该基因的工程菌及其表达方法

权利要求书

1.一种耐热柠檬酸合酶的基因，其特征在于，该耐热柠檬酸合酶的基因具有SEQ IDNO.1的碱基序列。

2.一种耐热柠檬酸合酶的基因工程菌，其特征在于，该工程菌构建方法包括引物设计、构建重组表达质粒和宿主菌转化，具体步骤如下：

1)引物设计：根据鱼腥藻PCC7120柠檬酸合酶基因(gltA)的基因序列设计出引物；

2)构建重组表达质粒：以鱼腥藻PCC 7120全基因组为模板，利用PCR扩增技术，得到含Nde I和Xho I酶切位点的目的基因片段，将目的基因片段与载体pET-28b同时双酶切后通过T4DNA连接酶连接，得到重组表达质粒pET-28b-gltA。

3)宿主菌转化：将重组质粒pET-28b-gltA转化到宿主菌感受态细胞中，经过抗性筛选后，获得表达耐热型柠檬酸合酶的基因工程菌。

3.根据权利要求2所述的耐热柠檬酸合酶的基因工程菌，其特征在于，所述引物为包含一个Nde I位点的正向引物gltAF和包含一个Xho I位点的反向引物gltAR，其中，正向引物的序列gltAF:5′-AAATGTGCATATGATGGTGTGCGAATACAAGCCTG-3′，反向引物gltAR：5′-AGCCGCTCGAGTTATTCCCCAGCTTTTAACGTTGGTCAA-3′。

4.根据权利要求2所述的耐热柠檬酸合酶的基因工程菌，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌(E.coli Rosetta(DE3))。

5.根据权利要求2所述的耐热柠檬酸合酶的基因工程菌，其特征在于，所述抗性筛选的试剂为卡那霉素和氯霉素。

6.一种表达权利2-5任一所述的耐热柠檬酸合酶的基因工程菌的方法，其特征在于，具体步骤如下：将基因工程菌先进行过夜培养，取培养菌液进行二次培养，然后再进行诱导培养，离心分离，得到菌体，向菌体中加入缓冲液，超声破碎，离心，上清液即为粗酶液，并采用用亲和层析法纯化粗酶液，得纯化目标蛋白。

7.根据权利要求6所述的表达耐热柠檬酸合酶的基因工程菌的方法，其特征在于，所述过夜培养和二次培养的培养基均为含卡那霉素30μg/mL和氯霉素30μg/mL的LB液体培养基，培养条件均为转速200-225rpm，温度33-39℃。

8.根据权利要求6所述的表达耐热柠檬酸合酶的基因工程菌的方法，其特征在于，所述诱导培养的诱导剂为浓度0.5mM的IPTG诱导剂，培养条件为转速170-190rpm，温度18-22℃且诱导剂在二次培养的菌浓度OD6oo达到0.4时加入。

9.根据权利要求6所述的表达耐热柠檬酸合酶的基因工程菌的方法，其特征在于，所述缓冲液为pH值为8.0的LEW Buffer缓冲液。