[发明专利]一种基于琼脂糖凝胶介质的全基因组扩增方法

说明书

本发明公开了一种基于琼脂糖凝胶介质的全基因组扩增方法，包括将多重链置换扩增反应体系置于琼脂糖凝胶中，在凝胶的网格状结构中，完成对目标基因组的全基因组扩增。凝胶状态的琼脂糖形成网格状结构，将多重链置换扩增反应体系相对分隔于微小的反应空间中，各微观反应单元之间的物质交换和相互影响大为减少，因此各微观反应单元以一个相对独立的状态发生反应，目标核酸各个片段之间的扩增一致性得到很大提升。同时，基于琼脂糖凝胶介质的多重链置换扩增，不需要预先制备微液滴发生装置或复杂反应微腔，并且在系统调试和扩增反应的过程中，不需要对微量液体进行精密和复杂的控制，简化了反应系统，降低了操作复杂度。

技术领域

本发明涉及一种基于琼脂糖凝胶介质的全基因组扩增方法，属于全基因组扩增技术领域。

背景技术

全基因组扩增(Whole genome amplification，WGA)是一种增加有限的DNA样本的数量的扩增方法。早期的WGA是基于聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)的技术，如简并寡聚核苷酸PCR(DOP–PCR)、引物延伸预扩增(PEP)以及适配子连接PCR等。在这些技术中使用的Taq DNA聚合酶，将片段大小限制在3kb，并且在序列中引入了很多错误。此外，这些技术不能完整地覆盖基因组，并且扩增是有偏性的。

近十几年来，使用随机六聚物与变性的DNA结合，然后在恒定的温度下，利用Phi29聚合酶进行链置换合成的多重链置换反应(Multiple displacement amplification，MDA)，成为全基因组扩增的主流方法，特别是能满足构建高通量DNA测序文库的需要。多重链置换反应产生的DNA片段长达100kb，可以完成对低起始量样本的准确且一定程度上的均匀扩增，但依然存在基因组内的扩增均一性较差，对基因组之间的杂合信息分辨率低等不足。

一些研究者将这两种方法混合使用，例如MALBAC(Science,2012,338:1627-1630)和PicoPLEX，在扩增的早期阶段采用随机引物和变温预扩增，后期采用聚合酶链式反应进行扩增的方法，但限制反应的循环数。然而这种混合并没有解决多重链置换反应的不足，与单纯使用PCR和MDA方法比较起来，这些方法也仅仅获得了中间效果。

也有一些基于微流控装置或微液滴的多重链置换扩增方法随后被开发出来，以改善传统多重链置换扩增方法在扩增均一性上的不足。Quake等人将传统的发生在离心管内的多重链置换反应转移到纳升的微流控反应微腔中(PLoS genetics,2007,3:1702-1708)，证实可以改善扩增反应的偏好性(bias)；在另一些报道中，多重链置换反应体系被转移进微液滴环境中(PNAS,2015,112:11923-11928；Nucleic acids research,2016,44:e66)，结果表明这些扩增偏好会在一定程度上得到抑制。

然而，反应微腔的制备和操作较为复杂，依赖精密的设备和精巧的操作，且费用较为高昂，从零散的材料和设备开始构建整个系统费时费力。将多重链置换扩增转移进油水混合的乳液环境同样对设备和操作的依赖性极大，商业化微液滴发生器机器配件价格较高，并且制备微乳液使用的表面活性剂在一定程度上影响反应的进行。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种基于琼脂糖凝胶介质的全基因组扩增方法，其通过琼脂糖凝胶形成的网格结构，将全基因扩增体系置于这种结构稳定的微小空间中，提升扩增的均一性，简化系统和实验流程，降低花费。

技术方案：为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种基于琼脂糖凝胶介质的全基因组扩增方法，包括将多重链置换扩增反应体系置于琼脂糖凝胶中(即置于琼脂糖溶液中，待琼脂糖溶液冷却为琼脂糖凝胶后)，在凝胶的网格状结构中，完成对目标基因组的全基因组扩增。

所述的多重链置换扩增，是采用具有链置换能力的核酸聚合酶和随机序列引物，在恒温的条件下，对目标基因组核酸片段进行扩增，提高其绝对质量。