[发明专利]一种基于细长反应腔的RNA转录组分析方法

说明书

本发明公开了一种基于细长反应腔的RNA转录组分析方法，包括将RNA反转录扩增反应体系注入细长型的反应腔中，完成对目标RNA转录组的捕获和放大。细长形的反应腔体将RNA反转录反应体系相对分隔于一个细长的反应腔中，各微观反应单元之间的物质交换和相互影响大为减少，因此各微观反应单元以一个相对独立的状态发生反应，目标RNA各个片段之间的扩增一致性得到很大提升。同时，基于细长反应腔的RNA转录组分析，不需要预先制备微液滴发生装置或复杂反应微腔，并且在系统调试和扩增反应的过程中，不需要对微量液体进行精密和复杂的控制，简化了反应系统，降低了操作复杂度。

技术领域

本发明涉及一种基于细长反应腔的RNA转录组分析方法，属于RNA转录组分析技术领域。

背景技术

RNA转录组，包括mRNA转录组、miRNA转录组和lncRNA转录组等，是指细胞或组织在特定状态下的RNA表达种类及丰度信息。对同一时空下不同来源样品(如疾病组织和正常组织)，或同一来源的不同时空样品(如细胞发育过程)的转录组信息进行比较，根据发生显著变化的转录组信息，可探索生物体个体发育、细胞分化衰老和凋亡的功能注释，寻找和疾病有关的标志基因，研究疾病的发生机制和治疗靶点等。

20世纪70年代中期开始，将mRNA反转录合成双链cDNA，再插入载体导入宿主细胞进行克隆扩增的cDNA克隆技术问世，构建cDNA文库成为研究功能基因组学的基本手段之一。成熟的RNA转录组分析技术，需要将RNA进行反转录和扩增，构建非偏性的cDNA文库，通过检测相同cDNA的数量，研究其对应的RNA的类型及表达量。对cDNA的传统检测，可以采用定量反转录PCR(RT-PCR)、荧光原位杂交(FISH)、表达谱芯片等方法。

在过去的10年中，随着测序技术的快速发展，将RNA反转录扩增为cDNA后采用高通量测序(即RNA-seq)技术的研究方法，在RNA转录组分析中有了越来越广泛的应用。RNA-seq技术不仅能鉴定已知参考基因组序列的样品基因表达情况，还可以检测到低表达丰度的基因，研究融合基因和lncRNA，发现新的基因、转录本和可变剪切。

美国FDA下属的测序质量控制项目(SEQC/MAQC-III)对RNA-seq技术与传统转录组分析技术在测序质量上进行了对比(Nature Biotechnology,2014,32:903-914)，研究表明，用RNA-seq检测基因的相对表达量可以得到更准确且可重复的结果，但和qPCR技术一样，存在基因特异性的偏好。

由于样本中不同基因的绝对表达量有差异，反转录扩增可能对低表达量的基因不敏感，文库制备过程及最终的测序结果都存在准确度和灵敏度的问题。因此cDNA文库的非偏性构建是准确分析RNA转录组的重要问题。一些基于微流控装置或微液滴的反转录扩增方法被开发出来，以改善传统反转录扩增方法在扩增均一性上的不足。

大量研究证实(Plos Genet,2007,3:1702-1708；PNAS,2015,112:11923-11928；Nucleic acids research,2016,44:e66)，在纳升体积容器中进行扩增反应，能有效提高反应效率，一定程度上抑制扩增偏好性。Wu等人开发了一种商业化的单细胞RNA-seq微流控平台(Nat Methods,2014,11:41-46)，研究表明在微流腔中进行cDNA制备的方法要优于离心管中的制备方法，尤其体现在检测的灵敏度大大增强。Streets等人构建了PDMS材料的微流控装置(PNAS,2014,111:7048-7053)，实现单细胞的准确捕获和mRNA的反转录扩增，并通过对双链cDNA的收集和建库测序，进行单细胞转录组学研究。结果表明，将微流控技术和高通量测序技术结合，能提高检测的灵敏度和准确度，这对于从技术噪声中分辨出生物变异尤其重要，且有益于大量样本的转录组学研究。