[发明专利]一种基于细长反应腔的多重PCR扩增方法

说明书

本发明公开了一种基于细长反应腔的多重PCR扩增方法，包括将多重PCR扩增反应体系注入细长形的反应腔中，完成对特定样本多个靶区域的核酸扩增。细长形的反应腔体将多重PCR扩增反应体系相对分隔于一个细长的反应腔中，各微观反应单元之间的物质交换和相互影响大为减少，因此各微观反应单元以一个相对独立的状态发生反应，目标核酸各个片段之间的扩增一致性得到很大提升。同时，基于细长反应腔的多重PCR扩增，不需要预先制备微液滴发生装置或复杂反应微腔，并且在系统调试和扩增反应的过程中，不需要对微量液体进行精密和复杂的控制，简化了反应系统，降低了操作复杂度。

技术领域

本发明涉及一种基于细长反应腔的多重PCR扩增方法，属于多重PCR扩增技术领域。

背景技术

多重PCR(multiplex Polymerase Chain Reaction)，即多重引物PCR或复合PCR技术，是一种将多对PCR引物置于一个反应体系中，同时进行扩增的PCR技术。多重PCR体系中的引物对，可以是放大不同DNA信息的独立引物对，也可以是扩增一个特定位置的多对引物组合。与普通PCR技术相比，多重PCR技术的优势在于将多个PCR反应减少为一个，极大降低了时间和人力成本。该技术诞生的20多年来，多重PCR技术在科学研究和临床医学等领域，特别是在疾病监测、微生物鉴定及法医领域，有非常广泛的应用。

随着分子生物学技术的不断进步，多重PCR扩增技术逐渐成熟，一次反应中参与的引物对可达几十甚至上百重。随之带来的问题就是扩增的特异性、灵敏度和均一性问题。多重PCR反应的灵敏度过低，会导致部分目标区域无法被检测到，使得扩增后的核酸质量和浓度难以满足各类应用的需求，特别是满足构建高通量DNA测序文库的需要。由于引物对间的相互影响，整个反应过程中的非特异扩增和不均匀扩增会增加，导致多重PCR的扩增特异性和均一性较差，特别会影响到科研及临床中的定量分析。

为解决这些问题，一种方法是优化扩增体系，包括引物的合理设计、聚合酶的选择和反应体系的优化。比如Han等人提出的Term(target-enriched multiplex)PCR技术和Arm(amplicon rescued multiplex)PCR技术。另一种方法是将芯片、微反应腔及微液滴等技术与之结合，对引物进行分离而实现均一性扩增的目的。Shen等人提出SlipChip技术，通过滑动上下两片形成特定的微腔，进行多重PCR扩增，但微腔的精确对准很难控制。

目前也有一些进行多重PCR的商业平台：美国AB公司的OpenArray平台、Fluidigm公司的Integrated Fluidic Circuits(IFCs)平台，及RainDance公司的微液滴系统。

然而，反应微腔的制备和操作较为复杂，依赖精密的设备和精巧的操作，且费用较为高昂，从零散的材料和设备开始构建整个系统费时费力。将多重PCR扩增转移进油水混合的乳液环境同样对设备和操作的依赖性极大，商业化微液滴发生器机器配件价格较高，并且制备微乳液使用的表面活性剂在一定程度上影响反应的进行。因此，低起始量多重PCR扩增、包含上百条引物对的多重PCR扩增等应用迫切需要一种高效、廉价且具有较好均一性的多重PCR扩增方法。

发明内容

发明目的：为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种基于细长反应腔的多重PCR扩增方法。该方法通过对反应腔的改造，将反应容器转换为细长的连续反应腔体，提升扩增的均一性，简化系统和实验流程，降低花费。

技术方案：为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种基于细长反应腔的多重PCR扩增方法，包括将多重PCR扩增反应体系注入细长形的反应腔中，完成对特定样本多个靶区域的核酸扩增。

所述的多重PCR扩增，是采用核酸聚合酶和多对引物，在适宜的温度控制下，对目标样本的多个靶区域进行核酸扩增，提高核酸的绝对质量。