[发明专利]一种细菌纤维素高产菌株的构建方法

说明书

本发明公开了一种细菌纤维素高产菌株的构建方法。即通过同源重组的方法敲除木葡萄糖醋酸杆菌中的葡萄糖脱氢酶基因，并通过外源引入FLP蛋白表达途径消除抗性标记基因。本发明还公开了利用所述方法构建的细菌纤维素高产菌株和利用该菌株生产细菌纤维素的方法。利用本发明的菌株可显著地提高细菌纤维素的产量。

技术领域

本发明涉及基因工程和发酵工程领域。确切的说，本发明涉及细菌纤维素的高产菌株及其制备方法。

背景技术

近年来，细菌纤维素由于其高纯度，以及优良的性质如高亲水性、高生物相容性以及良好的机械性能被广泛应用于各个行业，如生物医药行业中的伤口辅料，造纸行业中纸张的改性，以及食品行业。

木葡萄糖醋酸杆菌合成细菌纤维素有直接和非直接两种合成途径，其中非直接合成途径通过磷酸戊糖途径和糖异生途径合成细菌纤维素，在直接合成途径中己糖磷酸盐通过异构化和磷酸化，直接合成细菌纤维素。其中的4个主要酶促反应步骤：(1)葡萄糖在葡萄糖激酶的作用下合成6-磷酸葡萄糖；(2)6-磷酸葡萄糖在变位酶的作用下转变成1-磷酸葡萄糖；(3)1-磷酸葡萄糖在UDPG焦磷酸化酶的作用下转化为尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)；(4)UDPG在纤维素合成酶的作用下转化为β-1，4-葡萄糖苷链，再装配成细菌纤维素。

在木葡萄糖醋酸杆菌的代谢初期，约有95％葡萄糖将通过葡萄糖脱氢酶转化成葡萄糖酸。因此通过基因工程的手段将葡萄糖生成葡萄糖酸的代谢途径切除将有效地提高木葡萄糖醋酸杆菌的菌体量和细菌纤维素产量。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种细菌纤维素高产菌株的构建方法并利用这一构建方法构建得到细菌纤维素高产菌株。

为实现上述目的，本发明采用了以下构建方案：

一种细菌纤维素高产菌株的构建方法，包括以下步骤：

(1)葡萄糖脱氢酶编码基因的敲除：利用同源重组的方法对木葡萄糖醋酸杆菌目的基因进行基因敲除。

(2)敲除子的筛选：通过氨苄平板对敲除子进行筛选。

(3)氨苄抗性的消除：外源导入FLP合成系统对抗性标记进行消除。

(4)发酵培养：重组菌株发酵培养及产量的测定。

根据一种细菌纤维素高产菌株的构建方法，步骤(1)目的基因为葡萄糖脱氢酶编码基因。

根据一种细菌纤维素高产菌株的构建方法，步骤(2)氨苄平板为加入了氨苄青霉素的固体木醋培养基。

根据一种细菌纤维素高产菌株的构建方法，步骤(3)FLP合成系统是指通过ITPG诱导表达flp基因，抗性标记是指在基因重组过程中的氨苄抗性基因。

根据一种细菌纤维素高产菌株的构建方法，步骤(4)发酵培养过程所用到的培养基是木醋培养基：葡萄糖 25g/L 蛋白胨 10g/L yeast7.5g/L Na₂HPO₄10g/L。

本发明的的积极意义

1.本发明提供了一种细菌纤维素高产菌株的构建方法以及一种有效消除标记基因的方法。

2.本发明通过基因工程的手段，定向的编辑合成细菌纤维素过程中的关键基因，有效的提高了细菌纤维素的产量以及葡萄糖的利用率

3.本发明为其他细菌或真菌的代谢调控和基因编辑过程提供了方法。

附图说明

图1是构建的敲除质粒

具体实施方式

通过具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。