[发明专利]一种分泌表达海蠕虫透明质酸水解酶的重组酿酒酵母菌株

权利要求书

1.一种分泌表达海蠕虫透明质酸水解酶的重组酿酒酵母，其特征在于，是将来源于海蠕虫(Capitella teleta)的透明质酸水解酶基因转入酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中得到的基因工程菌；将缺失了TEF1启动子的pRS305、启动子GAP(m)、信号肽sp23、6个谷氨酰胺短肽和透明质酸水解酶基因连接成环，构成重组表达载体，所述重组酿酒酵母的宿主为S.cerevisiae CEN.PK2-1C，所述启动子GAP(m)的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；所述信号肽sp23的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述透明质酸水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的重组酿酒酵母的构建方法，其特征在于，具体步骤包括：

(1)合成来源于海蠕虫的透明质酸水解酶基因与启动子GAP(m)序列，所述透明质酸水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述启动子GAP(m)的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)将pRS305载体与透明质酸酶基因连接，获得含有海蠕虫透明质酸水解酶基因的重组质粒pRS305-HAase；

(3)以重组质粒pRS305-HAase为模板，通过PCR方法获得去除了TEF1启动子的pRS305-HAase核苷酸片段；

(4)利用一步法无缝克隆连接启动子GAP(m)核苷酸片段与缺失TEF1启动子的pRS305-HAase核苷酸片段，获得质粒pGAP(m)-HAase；

(5)以步骤(4)得到的质粒为模板，根据sp23信号肽序列设计引物进行PCR，将PCR产物磷酸化后连接，得到质粒pGAP(m)-sp23-Haase，所述信号肽sp23的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；

(6)以步骤(5)得到的质粒为模板，根据6个谷氨酰胺短肽序列设计引物进行PCR，将PCR产物磷酸化后连接，转化E.coli JM109，克隆得到整合载体pGAP(m)-sp23-6×Gln-HAase；

(7)将步骤(6)中得到的整合载体pGAP(m)-sp23-6×Gln-HAase转化到S.cerevisiaeCEN.PK2-1C中，获得重组酿酒酵母菌。

3.权利要求1所述的重组酿酒酵母在生产透明质酸水解酶中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将重组酿酒酵母接种于YPD培养基中，28-32℃，200-240r/min活化培养20-24h后，转接至发酵体系中发酵生产透明质酸水解酶。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，按5-15％接种量将活化培养后的培养液转接至含有1L的YPD培养基的3L容积发酵罐中，通气量1-3vvm，28-32℃，400-600r/min，使用氨水控制pH，当发酵液中葡萄糖浓度低于4g/L时，开始流加葡萄糖，使其浓度维持在0.5-1g/L，发酵90-100h。