[发明专利]一种高产琥珀酸的大肠杆菌及其应用

说明书

本发明公开了一种高产琥珀酸生产菌株的筛选与构建方法，属于生物工程技术领域。本发明通过从骆驼瘤胃内含物中分离出生产琥珀酸的野生菌株，并对该菌株的丙酮酸激酶进行蛋白质工程改造，降低丙酮酸激酶的酶活，得到突变株的琥珀酸产量在摇瓶水平提高了26.4％，在发酵罐中厌氧发酵55h，琥珀酸产量达到80.0g/L，琥珀酸酸生产强度达到1.45g/L/h。

技术领域

本发明涉及一种高产琥珀酸的大肠杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

琥珀酸，学名丁二酸，是一种重要的C4平台化合物。作为合成通用化学品的起始原料，琥珀酸在食品、化学、医药以及其他领域有广泛的应用，美国能源部2004年发布的报告中将琥珀酸列为12种最有潜力大宗生物基化学品中的第一位。

琥珀酸的传统生产方法是化学合成法，主要有石蜡氧化法、氯乙酸甲酯氰化水解法和五氧化二钒催化加氢法等，但由于石油资源的减少和环境污染日益严重等问题，化学合成方法的弊端日益显现。而通过发酵法生产琥珀酸，能够摆脱对不可再生的战略资源石油的依赖，利用可再生资源，固定二氧化碳减轻温室效应，展现出良好的发展前景。目前研究较多的产琥珀酸的菌种有：产琥珀酸放线杆菌、产琥珀酸厌氧螺菌和大肠杆菌。产琥珀酸放线杆菌通常是从自然界中筛选，进行定向改造，能够耐受高浓度的琥珀酸盐，Guettler M等人利用突变株产琥珀酸放线杆菌FZ53生产琥珀酸产量最高，以葡萄糖为碳源，发酵48h产量可以达到最高产量110g/L，关于产琥珀酸放线杆菌菌种的研究较少，需要进一步的对其生理特性、发酵性能和遗传背景进行研究。产琥珀酸厌氧螺菌可以利用的发酵底物比较广泛，例如葡萄糖、乳糖、甘油等，Samuelov等人的研究结果表明，在最适条件下，产琥珀酸厌氧螺菌琥珀酸的产率可以达到1.2mol/1.0mol葡萄糖，最高产量为65.0g/L，但是该菌株发酵需要严格的厌氧环境，工业化应用中很难实现。大肠杆菌作为模式菌株，遗传背景清晰，易操作，能够采用各种分子生物学的技术对菌种进行改造，所以采用大肠杆菌发酵琥珀酸已经成为一个热点，研究也取得了众多进展，Vemuri G N利用重组大肠杆菌AFP111进行两步法发酵76h，琥珀酸的最终浓度可达到99.2g/L。

目前大肠杆菌发酵的生产效率较低，最高为1.3g/L/h，发酵液中通常有乙酸、乙醇等副产物，以及不能耐受高浓度糖发酵等。为了获得高性能的生产菌株，通常需要利用传统选育手段、各种组学分析与分子生物学改造相结合的方法。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种大肠杆菌在生产琥珀酸中的应用，是通过抑制大肠杆菌中丙酮酸激酶的活性，提高大肠杆菌产琥珀酸的能力，具体步骤包括：

(1)克隆大肠杆菌中的丙酮酸激酶基因pykA；

(2)以克隆得到的丙酮酸激酶基因pykA作为亲本，构建酶活下降的丙酮酸激酶突变体；

(3)将大肠杆菌的丙酮酸激酶基因pykA替换为丙酮酸激酶突变体基因，得到重组大肠杆菌；

(4)在种子培养基中活化重组菌；

(5)接种活化后的重组菌到发酵培养基中发酵。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌包括大肠杆菌FMME-SuA(Escherichiacoli)，所述大肠杆菌已于2018年8月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2018568，保藏地址为中国湖北武汉，武汉大学。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中所述的丙酮酸激酶突变体包括pykA(N22A/N23A)，编码该酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中重组大肠杆菌构建方法包括用Red同源重组技术将原始菌株中的丙酮酸激酶基因pykA替换为酶活下降的丙酮酸激酶突变体基因。