[发明专利]一种高产琥珀酸的大肠杆菌及其应用有效
| 申请号： | 201811156449.1 | 申请日： | 2018-09-30 |
| 公开（公告）号： | CN109251941B | 公开（公告）日： | 2020-11-06 |
| 发明（设计）人： | 刘佳;刘立明;罗秋玲;陈修来 | 申请（专利权）人： | 江南大学;无锡宸明生物技术有限公司 |
| 主分类号： | C12P7/46 | 分类号： | C12P7/46;C12N1/21;C12N1/20;C12R1/19 |
| 代理公司： | 哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司 23211 | 代理人： | 张勇 |
| 地址： | 214000 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 高产 琥珀酸 大肠杆菌 及其 应用 | ||
1.一种大肠杆菌在生产琥珀酸中的应用，其特征在于，通过抑制大肠杆菌中丙酮酸激酶的活性，提高大肠杆菌产琥珀酸的能力，具体步骤包括：
(1)克隆大肠杆菌中的丙酮酸激酶基因pykA；
(2)以克隆得到的pykA作为亲本，构建酶活下降的丙酮酸激酶突变体；
(3)将大肠杆菌的丙酮酸激酶基因pykA替换为丙酮酸激酶突变体基因，得到重组大肠杆菌；
(4)在种子培养基中活化重组菌；
(5)接种活化后的重组菌到发酵培养基中发酵；
所述大肠杆菌为大肠杆菌FMME-SuA，所述大肠杆菌已于2018年8月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2018568，保藏地址为中国湖北武汉，武汉大学；
步骤(3)中所述的丙酮酸激酶突变体为pykA，编码该酶突变体的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示；
步骤(3)中重组大肠杆菌构建方法包括用Red同源重组技术将原始菌株中的丙酮酸激酶基因pykA替换为酶活下降的丙酮酸激酶突变体基因。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(4)所述的活化是将重组大肠杆菌在30-40℃，200rpm振荡培养12-14h。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(5)所述的发酵是按10-25％的接种量接种种子液至发酵培养基中，30-40℃下搅拌100-150rpm，厌氧发酵50-65h；所用培养基中包括：葡萄糖90-120g/L，玉米浆4-10g/L，Na2HPO4·12H2O 1-2g/L，NaH2PO4·2H2O 2-3g/L，MgSO4·7H2O 0.2-0.3g/L，CaCl2 0.1-0.2g/L。
4.一种产琥珀酸的大肠杆菌FMME-SuA，其特征在于，所述大肠杆菌已于2018年8月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2018568，保藏地址为中国湖北武汉，武汉大学。
5.一种重组大肠杆菌，其特征在于，是以权利要求4所述的大肠杆菌FMME-SuA为出发菌株，采用Red同源重组方法，将如SEQ ID NO.9所示的pykA基因的DNA片段导入大肠杆菌FMME-SuA中，替换大肠杆菌FMME-SuA中的丙酮酸激酶基因pykA得到的。
6.权利要求4所述的大肠杆菌在生产琥珀酸中的应用。
7.权利要求5所述的重组大肠杆菌在生产琥珀酸中的应用。
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