[发明专利]鳜鱼虹彩病毒与嗜水气单胞菌同步检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种鳜鱼虹彩病毒与嗜水气单胞菌同步检测试剂盒，其特征在于，其组成包括：

水 14.4 μL；

10×PCR缓冲液 2 μL；

25mmol/L MgCl₂ 1.6 μL；

200mmol/L 4×dNTP混合物 0.4μL；

引物 各0.2 μL；

5U/μl的Taq DNA聚合酶 0.2 μL；

模板DNA 1μL；

反应液A，1支，其体积百分比组成为：

①反应缓冲液，20%；

②dNTPs，4%，浓度为200mM/L；

③氯化镁水溶液，16%，浓度为25mM；

④Taq DNA聚合酶，2%，浓度为5U/μL；

⑤去离子水，58%；

反应液B：反应引物1，1支；其体积百分比组成为：ISKNV-mcp-F， 50%，浓度为10uM；ISKNV-mcp-R，50%，浓度为10 uM；

ISKNV-mcp-F为：TGACCAGCGAGTTCCTTGAC

ISKNV-mcp-R为：ATGCTGGGCGCAAAGTAGTA

反应液C：反应引物2，1支；其体积百分比组成为：Ah-alt-F，50%，浓度为10uM；Ah-alt-R，50%，浓度为10 uM；

Ah-alt-F为：TTCGCTGCGACAGCAGACTT

Ah-alt-R为：TGTACCTTGACGCCAGCCACG

鳜鱼虹彩病毒和嗜水气单胞菌混合基因组DNA的阳性对照试样，1支；

健康鳜鱼组织总DNA的阴性对照试样，1支；

超纯水，1支。

2.一种鳜鱼虹彩病毒与嗜水气单胞菌同步检测方法，其特征在于，该方法使用权利要求1所述的试剂盒；其步骤如下：

（1）DNA抽提：

①取发病鳜鱼肝组织样品增菌液1mL，12000 r/min离心1min，弃上清，将菌体悬浮于100μL的灭菌蒸馏水中，100℃煮沸10min，冰浴中冷却后12000 r/min离心10min，取上清作为PCR模板DNA1；

②取发病鳜鱼肝组织，置于无菌的1.5ml的离心管中，加入100µl LB2和20µlProteinase K 55℃孵育3h，使组织完全裂解；12000×g 离心5min，取上清，加500µl BB2混匀孵育10min，然后将全部溶液加入离心柱中，12000×g 离心30s，弃流出液；加入500µlCB2，12000×g 离心30s，弃流出液，重复一次；加入500µl WB2，12000×g 离心30s，弃流出液，重复一次，离心2min，彻底去除WB2；将离心柱置于干净的离心管中，加80µl 预热60℃-70℃的EB，室温静置1min，12000×g 离心1min，流出液即为所提的模版DNA2；

③将模板DNA1和DNA2按1:1混合作为实验总DNA；

（2）PCR扩增：向反应管中加入反应液A 10 μL，反应液B 1 μL，反应液C 1 μL，超纯水6μL，模板DNA 2 μL；PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，62℃退火1min，72℃延伸30s，34次循环；72℃延伸7min；4℃保温；同时进行阴性对照和阳性对照的扩增，其中阴性对照采用健康鱼组织总DNA的阴性对照试样，阳性对照采用鳜鱼虹彩病毒和嗜水气单胞菌混合基因组DNA的阳性对照试样；

（3）琼脂糖凝胶电泳检测：琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果，扩增出730bp和370bp两条扩增条带的为鳜鱼虹彩病毒病与细菌性败血症阳性，无扩增条带的为阴性。