[发明专利]一种基于适配体和链置换扩增反应对金黄色葡萄球菌的测定方法

说明书

一种基于适配体和链置换扩增反应对金黄色葡萄球菌的测定方法，属于分析化学及食品安全和发酵分析技术领域。本发明首先构建靶标识别体系，通过金黄色葡萄球菌与适配体之间的高度亲和力，可从双链中竞争释放cDNA；然后以cDNA为模板，在溶液中加入触发引物序列，扩增出大量具有特定序列的单链DNA；加入特定发夹结构后，单链DNA与发夹结构在溶液中自组装形成特定的六边形结构；最后加入荧光染料，染料与DNA双链特异性结合，释放荧光信号。利用荧光信号与金黄色葡萄球菌数量的线性关系来计算出样品中的金黄色葡萄球菌含量。本发明通过荧光共振能量转移原理，将荧光信号与金黄色葡萄球菌数量关联，实现了对牛奶等食物样品中金黄色葡萄球菌含量的直接测定。所建立的检测方法具有检测周期短，灵敏度高，成本低，特异性强等特点。

技术领域

本发明涉及一种基于适配体和链置换扩增反应对金黄色葡萄球菌的测定方法，可以对食品和发酵样品中金黄色葡萄球菌含量进行高灵敏的测定，属于分析化学及食品安全和发酵分析技术领域。

背景技术

金黄色葡萄球菌是一种常见的人类病原体，多见于生牛乳和生肉中，可产生多种内毒素，引起各种感染和食源性疾病，例如败血症，感染性心内膜炎（IE），以及骨关节炎，皮肤和软组织，胸膜肺等，严重威胁人类健康，人群中大约有30%的金黄色葡萄球菌携带者。同时金黄色葡萄球菌也常是发酵过程中的污染菌。因此研发对金黄色葡萄球菌的高灵敏、准确的检测方法，对于食品安全监测和发酵分析、临床预防及治疗金黄色葡萄球菌引起的多种感染具有重要的意义。

目前，检测金黄色葡萄球菌的方法包括传统培养，生化检测（如显色培养基），免疫学方法（如酶联免疫检测法），分子生物学方法（如多重PCR技术）等。其中，传统培养和生化检测方法检测时间长，容易受到杂菌菌落形态和数量以及变种金黄色葡萄球菌的影响，出现假阴性结果；免疫学方法试验周期长，步骤繁琐，各种非相关抗原易引起交叉反应，食物加热过程中产生的肠毒素蛋白凝集等会造成检测结果的假阳性或假阴性；分子生物学方法同样容易受到样品成分等因素的影响。这些常用的检测金黄色葡萄球菌的方法或需要长时间的处理、熟练的工作人员和昂贵的实验室设备，或具有不稳定、灵敏度低、准确性差等缺点。因此建立灵敏高效的金黄色葡萄球菌检测方法，对于食品安全监控和发酵过程监控等均具有重要的意义。

近年来，随着组合化学和生物传感技术的发展，多种基于适配体的生物传感器被用来检测病原微生物。这些生物传感器由检测元件和识别元件构成，通过信号转换来检测目标物质如电化学传感器，荧光传感器，比色传感器等。适配体通过SELEX筛选技术获得，是对特定靶标具有高亲和力和特异性的DNA或RNA分子。与抗体相比，适配体更易合成和储存，从而拓宽了它们的应用。更重要的是，许多基于核酸分子的信号放大方法进一步拓宽了适配体传感器的检测范围，如滚环扩增技术（RCA）、链置换扩增技术（SDA）和杂交链式反应（HCR）等，这些技术在DNA／RNA体外定性检测中得到了越来越广泛的应用。生物传感器具有检测快速，特异性高，灵敏度强，可重复使用等特点，其应用范围也日渐广泛。

发明内容

本发明的目的是克服上述不足之处，建立一种基于适配体和链置换扩增反应对金黄色葡萄球菌进行高灵敏、高特异性、准确的测定方法。