[发明专利]嵌合抗原受体、其制备方法、利用其修饰的NK细胞及治疗HBV感染的应用

说明书

本发明涉及嵌合抗原受体、其制备方法、利用其修饰的NK细胞及治疗HBV感染的应用，嵌合抗原受体，包含leader核酸人工序列、HBsAg单链抗体核酸人工序列、CD8α铰链区核酸人工序列、NKG2D跨膜区核酸人工序列、2B4共刺激区核酸人工序列、CD3ζ信号传导区核酸人工序列、T2A自剪切区核酸人工序列、IFN‑α核酸人工序列、RQR8分子开关区核酸人工序列。本发明针对共同“α”决定簇特异性抗体，可以识别不同亚型中的HBsAg，因此本发明Anti‑HBsAg‑IFN‑α‑CAR NK细胞对所有HBV亚型感染都有治疗作用，同时也减少治疗剂量和毒副反应。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及嵌合抗原受体、其制备方法、利用其修饰的NK细胞及治疗HBV感染的应用。

背景技术

HBV感染是一个威胁人类健康的全球性公共卫生问题，是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)引起的传染病。据估计，全世界大约有20亿人口曾经感染过乙型肝炎病毒，其中慢性HBV感染者达到了近2.4亿至3.5亿，其中25％的患者因HBV引起终生感染而导致肝硬化或癌症。目前公认的化学治疗方法包括干扰素-α(Interferon-α，IFN-α)和核苷类似物。核苷类似物是通过多功能逆转录酶来阻断病毒DNA的合成。口服核苷酸类似物可以有效降低病人体内HBV-DNA的水平，但存在停药后病毒爆发的危险。因此病人需要长期服药，然而长期服用核苷酸类似物又会导致抗药性的产生。干扰素能通过抑制病毒DNA复制和激活机体抗病毒免疫来达到治疗效果。但是在接受干扰素治疗的病人中只有不足10％产生持续的治疗作用。并且干扰素的副作用多(比如流感样症状、疲劳和血球计数低等)且具有严格的适应症。如何控制和清除HBV 的感染、减缓甚至终止肝硬化的发展，降低肝癌的发生率是目前医学界的重大课题。

HBV属于DNA病毒，基因组长约3200bp，是一种相当小的病毒，为部分双链环状DNA，由一条较短的正链及一条较长的负链构成，其中负链有四个开放式阅读框，即S、P、C及X区，能够编码全部的病毒蛋白，包括表面抗原(HBsAg)、核心抗原(HBcAg)、X蛋白和病毒聚合酶在内的四种蛋白。目前对于HBV的分类方法有两种，一是根据HBsAg表面抗原决定簇的不同，可以将其分为不同亚型，主要包括：adw、adr、ayw和ayr；另一个则是以据HBV全基因组序列差异性不小于8％的标准或者S因组序列差异性不小于4.2％的标准，将HBV分为 A-H八类。不同HBV基因型的分布具有明确的地域特征，我国以B型及C型为主，且南方多为C基因型，而北方多为B基因型。

HBV具有严格的种属特性主要感染人类及灵长类动物。其感染宿主肝细胞及增殖过程大致如下；HBV可以附着到细胞表面并结合进入钠离子-牛磺胆酸共转运多肽受体。期间或即刻启动进入程序，首先脱去包膜蛋白(即乙肝表面抗原HBsAg)，后脱去包膜的病毒衣壳进入肝细胞，衣壳中含有HBV松弛状的双链DNA(Relaxed circular DNA，rcDNA)，然后rcDNA被运输至细胞核。在细胞核内rcDNA一部分整合到基因组上，另一部分可以转化成共价闭合环状的超螺旋DNA分子即cccDNA，其过程是DNA聚合酶将具有缺口的rcDNA的两条链补齐，形成cccDNA。然后cccDNA作为模板，利用宿主RNA聚合II，转录生成mRNA，其中长度为3.5kb的mRNA携带HBV DNA序列的所有上遗传信息，称为前基因组RNA(Pregenomic RNA，pgRNA)。pgRNA出细胞核同P区编码的聚合酶结合，后被核心蛋白包裹，到此核衣壳形成。然后在HBV聚合酶的作用下，以pgRNA为模板，合成负链DNA，然后再以负链为模板合成正链DNA，由此产生了子代的部分双链环状DNA，最后到达内质网膜进行包膜，形成完整的HBV 被释放至肝细胞外。肝细胞质中的子代部分双链环状DNA也可进入细胞核内，再形成cccDNA并继续复制。

由于HBV病毒亚型众多，目前的嵌合抗原受体及细胞无法对不同的亚型识别，导致治疗的范围比较局限。

因此，开发新的嵌合抗原受体、其制备方法、利用其修饰的NK细胞及治疗HBV感染的应用，不但具有迫切的研究价值，也具有良好的经济效益和工业应用潜力，这正是本发明得以完成的动力所在和基础。