[发明专利]嵌合抗原受体、其制备方法、利用其修饰的NK细胞及治疗HBV感染的应用

权利要求书

1.嵌合抗原受体，其特征在于：包含leader核酸人工序列、HBsAg单链抗体核酸人工序列、CD8α铰链区核酸人工序列、NKG2D跨膜区核酸人工序列、2B4共刺激区核酸人工序列、CD3ζ信号传导区核酸人工序列、T2A自剪切区核酸人工序列、IFN-α核酸人工序列、RQR8分子开关区核酸人工序列；

其中，具体地，所述嵌合抗原受体包含依序连接的

如SEQ ID NO.2所述的leader核酸人工序列；

如SEQ ID NO.3所述HBsAg单链抗体核酸人工序列；

如SEQ ID NO.4所述CD8α铰链区核酸人工序列；

如SEQ ID NO.5所述NKG2D跨膜区核酸人工序列；

如SEQ ID NO.6所述2B4共刺激区核酸人工序列；

如SEQ ID NO.7所述CD3ζ信号传导区核酸人工序列；

如SEQ ID NO.8所述T2A自剪切区核酸人工序列；

如SEQ ID NO.9所述IFN-α核酸人工序列；

如SEQ ID NO.8所述T2A自剪切区核酸人工序列；

如SEQ ID NO.10所述RQR8分子开关区核酸人工序列。

2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体的核酸序列如SEQ ID NO.1所述。

3.如权利要求1所述的嵌合抗原受体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）分别按leader核酸人工序列、HBsAg单链抗体核酸人工序列、CD8α铰链区核酸人工序列、NKG2D跨膜区核酸人工序列、2B4共刺激区核酸人工序列、CD3ζ信号传导区核酸人工序列、T2A自剪切区核酸人工序列、IFN-α核酸人工序列、T2A自剪切区核酸人工序列、RQR8分子开关区核酸人工序列合成其整个表达框并插入标准载体pUC上，得到pUC-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR；

（2）将pUC-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR进行双酶切，利用琼胶电泳将Anti-HBsAg-IFN-α-CAR DNA片段琼胶部位切下，利用DNA extraction kit溶胶液处理、过DF柱弃滤液、漂洗DF柱、空离、洗脱DF柱、收集离心物，得到纯化的Anti-HBsAg-IFN-α-CAR DNA片段，即为嵌合抗原受体。

4.NK细胞，其特征在于：该NK细胞含有如权利要求1或2所述的嵌合抗原受体。

5.如权利要求4所述的NK细胞，其特征在于：所述NK细胞采用包括如下步骤的方法制备得到：首先将pLent-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR质粒进行慢病毒包装，然后利用重组慢病毒感染免疫细胞。

6.如权利要求5所述的NK细胞，其特征在于：所述pLent-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR质粒是将融合基因片段Anti-HBsAg-IFN-α-CAR DNA插入慢病毒表达载体pLent-C-GFP得到的pLent-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR质粒。

7.如权利要求6所述的NK细胞，其特征在于：所述pLent-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR 质粒采用包括如下步骤的制备方法得到：将纯化的Anti-HBsAg-IFN-α-CAR DNA片段和线性化的pLent-C-GFP DNA片段在16℃进行过夜连接形成pLent-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR质粒；连接体系为：10×buffer：1µl；T4连接酶：1µl；Anti-HBsAg-IFN-α-CAR DNA：4µl；线性化的pLent-C-GFP DNA：4µl。

8.如权利要求1所述的嵌合抗原受体在制备治疗HBV感染方面的药物中的应用。