[发明专利]一种改进的氰基还原酶及其在合成3-氯吡嗪-2甲胺中的应用

说明书

本发明公开了一种改进的氰基还原酶及其在合成3‑氯吡嗪‑2甲胺中的应用，其特征在于：所述改进的氰基还原酶是以SEQ ID No.2所示氨基酸序列为出发序列，将第120位丙氨酸突变为亮氨酸，并将第155位的谷氨酸突变为赖氨酸得到的突变体；在pH6～8的磷酸钾缓冲液中，分别添加葡萄糖、辅酶NADP、2‑氯‑3‑氰基吡嗪、葡萄糖脱氢酶以及改进的氰基还原酶组成反应混合液，在30～40℃下进行还原反应24h，生成3‑氯吡嗪‑2甲胺，本发明反应条件温和，有机溶剂用量小，反应体系更绿色环保，转化率高，大大提高了3‑氯吡嗪‑2甲胺的制备效率，具有较好的工业应用前景。

技术领域

本发明属于生物催化领域，具体涉及一种改进的氰基还原酶及其在合成3-氯吡嗪-2甲胺中的应用。

背景技术

3-氯吡嗪-2甲胺是阿卡拉布替尼(Acalabrutinib)的关键中间体，阿卡拉布替尼是由Acerta公司研发的第二代布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂，能促进慢性淋巴性白血病(CLL)患者体内的持久的高应答率。2017年，该药物获FDA批准上市，适应症为套细胞淋巴瘤。

目前，利用化学方法合成3-氯吡嗪-2甲胺的报道较多，主要以2-氯-3-氰基吡嗪为原料，经还原而制得3-氯吡嗪-2甲胺，此类方法有机溶剂使用量大，操作环节较多，制备周期较长，产率较低，且存在重金属污染，生产成本较高等缺陷。与化学方法相比，生物催化具有反应条件温和、效率高、立体选择性强、环境友好等优点。利用分子改造技术对生物催化剂进行改进优化，提高催化效率和稳定性，使其能够更好地满足生产工艺需求。因此，生物催化在药物合成方面具有较好的应用前景。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。

因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种改进的氰基还原酶及其在合成3-氯吡嗪-2甲胺中的应用。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种改进的氰基还原酶，其特征在于：所述改进的氰基还原酶是以SEQ ID No.2所示氨基酸序列为出发序列，将第120位丙氨酸突变为亮氨酸，并将第155位的谷氨酸突变为赖氨酸得到的突变体，氨基酸序列为SEQ ID No.4所示。

作为本发明所述的氰基还原酶的一种优选方案，其中：所述改进的氰基还原酶，还包括，以SEQ ID No.2所示氨基酸序列为出发序列，将第59位酪氨酸突变为丙氨酸，第120位的丙氨酸突变为亮氨酸，第155位的谷氨酸突变为赖氨酸，第211位的谷氨酸突变为精氨酸，氨基酸序列为SEQ ID No.6所示。

作为本发明所述的氰基还原酶的一种优选方案，其中：所述改进的氰基还原酶，还包括，以SEQ ID No.2所示氨基酸序列为出发序列，将第59位酪氨酸突变为丙氨酸，第75位的甘氨酸突变为脯氨酸，第120位的丙氨酸突变为亮氨酸，第137位的苏氨酸突变为丝氨酸，第155位的谷氨酸突变为赖氨酸，第169位的丙氨酸突变为苏氨酸，第211位的谷氨酸突变为精氨酸，氨基酸序列为SEQ ID No.8所示。

本发明的再一个目的是提供改进的氰基还原酶在催化2-氯-3-氰基吡嗪发生还原反应生成3-氯吡嗪-2甲胺中的应用。

作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述的改进的氰基还原酶在催化2-氯-3-氰基吡嗪发生还原反应生成3-氯吡嗪-2甲胺中的应用是在pH6～8的磷酸钾缓冲液中，分别添加葡萄糖、辅酶NADP、2-氯-3-氰基吡嗪、葡萄糖脱氢酶以及权利要求1～3任一所述改进的氰基还原酶组成反应混合液，进行还原反应生成3-氯吡嗪-2甲胺。