[发明专利]一种马铃薯X病毒粒体的原位分离固定电子显微镜诊断方法

说明书

本发明提供了一种马铃薯X病毒粒体的原位分离固定电子显微镜诊断方法，包括取样、切丝固定、负染色、电镜观察分析等步骤。整个过程仅用时十几分钟，具有快速、准确、高效等特点。

技术领域

本发明属于植物保护领域，进一步属于植物病毒的鉴定与检测，具体涉及马铃薯X病毒的原位分离固定负染色电子显微镜诊断方法。

背景技术

马铃薯X病毒（Potato virus X, PVX）是马铃薯X病毒属（Potexvirus）的典型成员，是马铃薯的重要病毒病原之一，最早由Smith于1931年记述。PVX主要通过机械磨擦接触传播，寄主范围较广，可侵染16科240多种植物，茄科是主要的寄主。PVX在全球马铃薯产区广泛发生分布，侵染马铃薯大多引起轻花叶症状，对产量损失影响较小，与马铃薯Y病毒（Potato Virus Y, PVY）复合侵染时引起重花叶或严重皱缩、植株矮化，引起马铃薯产量的严重损失。但是，在易感品种中引起重花叶症状，随着毒源在马铃薯薯块中的积累，引起的产量损失高达90%以上，如云南香格里拉马铃薯主栽品种中甸红。

PVX是单分基因组RNA病毒，由亚基因组RNA编码功能蛋白，除聚合酶与外壳蛋白外，三个蛋白（25kDa、8kDa、12kDa）与病毒的细胞间运动相关。PVX病毒粒体为弯曲线状，直径13nm，长度500～520nm（平均为515nm）不等。

PVX在马铃薯生产上以种苗、种薯传播为主，带毒种苗种薯中毒源量积累以及远距离传播，导致病害发生日益严重，发生范围不断扩大。马铃薯生产上PVX的防控方法主要是检测筛选应用无病毒种苗种薯，检测方法以酶联免疫吸附试验（ELISA）为主，通过制备PVX外壳蛋白抗体进行间接检测，灵敏度较低且需要样品量较大。也有应用反转录多聚酶链式反应（RT-PCR）检测，通过设计外壳蛋白基因引物，从病组织提取RNA为模版进行扩增，灵敏度较高，但是成本较高且耗时较长，而且是间接检测方法。间接检测方法如ELISA的优势是成本低，可用于大量样品检测，其局限是难以避免假阳性反应（或非特异性反应）的问题。常规电子显微镜检测以病组织研磨制样或通过化学沉淀差速离心进行负染色制样，容易破坏病毒粒体结构及难以反映其原位分布或聚集特征，观察结果不易判断。

为此，本发明改进了现有的透射电镜的样品制备方法，提供了一种快速诊断马铃薯X病毒的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种马铃薯X病毒的原位分离固定负染色电子显微镜诊断方法，所述方法包括如下步骤：

（1）取1mm×2mm×6mm大小的感病组织；

（2）将所述感病组织用徒手切片法切成细丝；

（3） 加入固定液固定2~3min；

（4）将覆盖有Formvar膜和碳膜的铜网膜面朝下吸附样品浸出液1~3 min，然后用滤纸沿铜网边缘吸附，膜面朝上放置1 min；

（5）将染液滴于疏水膜上，再将所述铜网面朝下置于染液染色1~3 min，然后用滤纸沿铜网边缘吸附，膜面朝上放置1 min；

（6）透射电镜上样、观察和拍照；

（7）根据病毒粒体的分布与聚集特征进行判断。

附图说明

图1 游离的PVX病毒粒体呈随机散布；

图中，白箭头所指为结构完整的病毒粒体，直径12～13nm，头尾大小不均一，长度510～520nm；黑箭头所指为装配不完整的较短的病毒粒体。

图2 PVX病毒粒体呈规则的纵向排列（白箭头）和分布散布的单个病毒粒体（黑箭头）。

图3 PVX病毒粒体呈集块状交叉聚集（宽箭头所指）。