[发明专利]一种单子叶植物miRNA高效过表达载体的构建方法

说明书

本发明属于生物技术领域，公开了一种单子叶植物miRNA高效过表达载体的构建方法,包括以下步骤：S1,针对目标miRNA,制备与之对应的连接序列；S2,将S1所述连接序列克隆至克隆载体，以获得启动子‑连接序列‑终止子结构；S3，将用于过表达目标miRNA的茎环结构,导入到S2所述启动子‑连接序列‑终止子结构，以使其具有至少两所述茎环结构；S4，通过双酶切的方式将S3所得的启动子‑连接序列‑终止子结构克隆至双元载体。本发明连接效率高，操作简便易行，并可避免引入不必要的转基因成分，利于单子叶植物miRNA的功能研究，更有利于后续转基因植株的表型观察和结果解释。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种单子叶植物miRNA高效过表达载体的构建方法，可用于单子叶植物miRNA功能的研究。

背景技术

植物microRNA(miRNA)是一类长度约为20～24nt的內源性非编码小RNA(smallnon-coding RNA)，可与Argonaute(AGO)蛋白等结合形成RISC复合体(RNA-inducedsilencing complex)，通过直接切割靶基因的mRNA或抑制靶基因的翻译，以及通过切割来源于PHAS位点的转录本产生的大量phasiRNA间接作用于靶基因mRNA，实现对靶基因表达的抑制，进而影响植物生长发育过程，主要包括根的形成、茎和叶的发育、花器官的形成、果实的发育等以及生物和非生物胁迫的响应。

植物miRNA基因的过表达是研究其功能的重要策略之一。目前常用的miRNA过表达方法是将目的miRNA的前体序列克隆到特定启动子驱动的双元载体后再转化目的植物，进而研究miRNA的功能，该方法常用的35S启动子在单子叶植物中表达较弱，对单子叶植物限制较大，部分环节操作难度较大。上述方法还常因目的miRNA表达量的不足而出现过表达植株表型不明显、单酶切连接效率低、容易引入不必要的转基因成分等不足。因此有必要对以上不足加以改进。

发明内容

为克服传统植物miRNA过表达方法存在的目的miRNA表达量的不足而出现过表达植株表型不明显的问题，发明人发现玉米Ubi启动子在单子叶植物组织中高效表达，在双子叶植物中则较弱，基于此提出了一种单子叶植物miRNA高效过表达载体的构建方法，其包括以下步骤：S1,针对目标miRNA,制备与之对应的连接序列；

S2,将S1所述连接序列克隆至克隆载体，以获得启动子-连接序列-终止子结构；

S3，将用于过表达目标miRNA的茎环结构,导入到S2所述启动子-连接序列-终止子结构，以使其具有至少两所述茎环结构；

S4，通过双酶切的方式将S3所得的启动子-连接序列-终止子结构克隆至双元载体。

优选的,在所述启动子-连接序列-终止子结构中，启动子包括Ubi启动子，终止子包括Nos终止子。

优选的,在S2中，所述启动子-连接序列-终止子结构的两端均连接有酶切位点。

优选的,在S2中，所述启动子-连接序列-终止子结构的两端分别连接有PacI酶切位点和MluI酶切位点。

优选的,在S4中，所述启动子-连接序列-终止子结构克隆至双元载体后，其两端分别连接有PacI酶切位点和MluI酶切位点。

优选的,在S3中，通过酶切和连接的方式将所述茎环结构到导入到所述启动子-连接序列-终止子结构中。

优选的，在S2中，所述克隆载体包括pOT2-polycis-UN；在S4中，所述双元载体包括pCAMBIA1390-PM或pFGC5941-PM。

优选的，双酶切所用内切酶为限制性内切酶，并包括PacI内切酶或MluI内切酶。