[发明专利]一种单子叶植物miRNA高效过表达载体的构建方法有效
| 申请号： | 201811093478.8 | 申请日： | 2018-09-19 |
| 公开（公告）号： | CN109161558B | 公开（公告）日： | 2022-05-06 |
| 发明（设计）人： | 唐贵良;杨晓玉;李琳;罗淋淋;刘琳;罗光宇 | 申请（专利权）人： | 深圳大学 |
| 主分类号： | C12N15/66 | 分类号： | C12N15/66 |
| 代理公司： | 深圳市韦恩肯知识产权代理有限公司 44375 | 代理人： | 李玉平 |
| 地址： | 518054 广东*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 单子叶植物 mirna 高效 表达 载体 构建 方法 | ||
1.一种单子叶植物miRNA高效过表达载体的构建方法,其特征在于,包括以下步骤：
S1,针对目标miRNA,制备与之对应的连接序列；
S2,将S1所述连接序列克隆至克隆载体，以获得启动子-连接序列-终止子结构；
S3，将用于过表达目标miRNA的茎环结构,导入到S2所述启动子-连接序列-终止子结构，以使其具有至少两所述茎环结构；
S4，通过双酶切的方式将S3所得的启动子-连接序列-终止子结构克隆至双元载体；
所述目标miRNA为水稻miR444.1、miR444.3或miR529a，与水稻miR444.1对应的连接序列的引物如SEQ ID No.16和SEQ ID No.17所示，与水稻miR444.3对应的连接序列的引物如SEQ ID No.18和SEQ ID No.19所示，与水稻miR529a对应的连接序列的引物如SEQ IDNo.20和SEQ ID No.21所示；
所述步骤S3中，用于过表达水稻miR444.1的茎环结构的序列如SEQ ID No.22所示，用于过表达水稻miR444.3的茎环结构的序列如SEQ ID No.23所示，用于过表达水稻miR529a的茎环结构的序列如SEQ ID No.24所示。
2.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,在所述启动子-连接序列-终止子结构中，启动子包括Ubi启动子，终止子包括Nos终止子。
3.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,在S2中，所述启动子-连接序列-终止子结构的两端均连接有酶切位点。
4.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,在S2中，所述启动子-连接序列-终止子结构的两端分别连接有PacI酶切位点和MluI酶切位点。
5.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,在S4中，所述启动子-连接序列-终止子结构克隆至双元载体后，其两端分别连接有PacI酶切位点和MluI酶切位点。
6.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,在S3中，通过酶切和连接的方式将所述茎环结构到导入到所述启动子-连接序列-终止子结构中。
7.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,在S2中，所述克隆载体包括pOT2-polycis-UN；在S4中，所述双元载体包括pCAMBIA1390-PM或pFGC5941-PM。
8.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,在S4中，双酶切所用内切酶为限制性内切酶，并包括PacI内切酶或MluI内切酶。
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