[发明专利]一种多通道同时区分检测Cys/Hcy，GSH和H2S的荧光探针的设计、合成及应用

说明书

本发明涉及一种多通道同时区分检测Cys/Hcy，GSH和H₂S的荧光探针的制备方法以及该荧光探针在体外和活细胞内检测Cys/Hcy，GSH和H₂S方面的应用。该探针化合物的结构式如式(I)所示。我们将两种识别基团通过染料的桥连构建到一个分子上，通过不同的生物硫醇亲核性的差异来获得不同的荧光信号组合，从而达到区分生物硫醇的目的。此外该系列化合物有望在生物医药，光电以及环境保护领域有着较好的应用前景。

技术领域

本发明涉及的是化学分析检测技术领域，具体涉及一种多通道同时区分检测Cys/Hcy， GSH和H₂S的荧光探针的制备方法以及该荧光探针在体外和活细胞内检测Cys/Hcy，GSH和 H₂S方面的应用。

背景技术

生物硫醇研究发现这些生物硫醇在人体生理系统中发挥着重要的作用，与各种疾病的 发生，监测和治疗密切相关。谷胱甘肽(GSH)是目前已知的最丰富的细胞内生物硫醇，可以 保护蛋白质硫醇免受氧化，减轻肝脏损伤，增强癌症患者的抗氧化能力，协同治疗糖尿病及 并发症等。半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hcy)的异常含量是多种疾病的危险因素，包括 神经退行性疾病，心脑血管疾病，癌症，糖尿病和并发症，先兆子痫和眼部疾病。硫化氢(H₂S) 作为继一氧化碳(CO)和一氧化氮(NO)之后的第三种气体信号传递分子，在松弛平滑肌， 调节神经传递和调节胰岛素释放中起重要作用。并且研究人员发现这些生物硫醇之间具有非 常紧密的联系。在胱硫醚-β-合成酶(CBS)的催化作用下，Hcy与丝氨酸缩合形成胱硫醚，胱 硫醚进一步被胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)催化形成Cys。在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)和 谷胱甘肽合成酶的连续作用下，GSH通过Cys与谷氨酸和甘氨酸的结合产生。而H₂S可以通 过胱硫醚-β-合成酶和胱硫醚-γ-裂解酶催化Cys和Hcy产生。所以，一种硫醇的含量变化直接 影响到其它硫醇的含量。因此，开发一种方法能够同时区分检测Cys,Hcy,GSH和H₂S变的 非常重要。

近年来，荧光探针由于其实时成像，高灵敏度，高选择性和操作简单等特点，广泛用于检测生物分子。虽然已经开发了许多荧光探针来检测生物硫醇，但由于其相似的结构和反应 活性，它们中的大多数不能同时区分Cys/Hcy，GSH和H₂S。林伟英课题组报道了一种设计荧光探针分子的策略，通过多种荧光信号的组合来实现对多种生物硫醇的区分检测。受到这 一策略的启发，我们在课题组前期研究的基础上，我们将两种识别基团通过染料的桥连构建 到一个分子上，通过不同的生物硫醇亲核性的差异来获得不同的荧光信号组合，从而达到区 分生物硫醇的目的。

发明内容

本发明目的之一是提供一种合成路线简单、反应条件温和、成本较低的荧光探针合成 方法；目的之二是提供一种灵敏度高、选择性好，抗干扰能力强，斯托克斯位移大，发射波 长在近红外，能够对体外或者活细胞内的Cys/Hcy，GSH和H₂S进行监测或者细胞成像的荧 光探针。

本发明解决问题采取的技术方案为，一种可以特异性识别半胱氨酸的新型荧光探针， 其分子结构式如下：合成路线如下：

具体合成方法如下：(1)将间苯二酚(2.2g，20mmol)，4-氯乙酰乙酸乙酯(3.3g，20mmol)置于100mL圆底烧瓶中，加入对甲苯磺酸(0.35g，2mmol)和30mL甲苯，120℃下搅拌反 应5h，TLC监测反应完成后，停止反应，减压蒸馏除去溶剂，得到棕色粘稠状固体2。向反 应瓶中加入50mL蒸馏水，100℃搅拌回流反应48h，停止反应，趁热抽滤，滤液冷却析出 固体，待析出充分后，抽滤干燥得米白色固体。