[发明专利]用于检测鲤春病毒的特异性引物对、探针、检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于检测鲤春病毒的特异性引物对。本发明还公开了与所述的引物对配合使用的探针。本发明还公开了一种检测试剂盒。本发明以鲤春病毒中糖蛋白G基因为检测靶点，通过恒温扩增技术，使用特异性的引物和探针组合，提高了鲤春病毒的检测便捷性和特异性，同时检测时间也大大缩短。与PCR检测方法相比，本发明的方法省去了产物电泳验证过程，避免了假阳性结果出现，提高检测的准确度。与qPCR相比，本发明的方法简便易行，也不需要操作复杂的仪器设备，节约了成本，提高了检测效率，同时便于在大范围内推广使用。与其他恒温扩增方法相比，本发明的检测方法所需时间更短，检测的准确率更高。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及用于检测鲤春病毒的特异性引物对、探针、检测试剂盒。

背景技术

鲤春病毒血症(spring viraemia of carp，SVC)是一种由病毒引起的，发生在鱼类中的出血性、高传染性疫病，经常在鲤科鱼类，尤其是鲤、锦鲤，常爆发于春季，导致患病鱼大量死亡，给渔农带来巨大的经济损失。依照国际动物卫生组织(OIE)的规定，鲤春病毒血症是必须向OIE申报的疾病，同时也是《中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》中的二类动物疫病。该病的病原为鲤春病毒血症病毒(spring viraemia of carpvirus，SVCV)，又名鲤鱼弹状病毒(Rhabdovirus carpio)，属于弹状病毒科，水泡病毒属(Vesiculorirus)。该病毒的基因组为单股、负链、不分节段的RNA，长约11019个核苷酸，主要包含5个基因。

目前鲤春病毒检测的“金标准”是通过细胞培养的方法，分离出病毒，再利用免疫学技术进行鉴定，病毒的整个培养和检测过程周期较长且工作量大，不符合快速检测的原则。为了减轻鲤春病毒培养法的工作量，缩短检测时间，需要一种快速简单的检测方法来检测鲤春病毒。因此出现了灵敏度和准确性更高的PCR(Polymerase Chain Reaction)检测鲤春病毒。

PCR以4种dNTP为底物，在引物存在的情况下，在DNA模板的3’末端进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板核酸得到指数级的扩增。由于鲤春病毒是一种RNA病毒，因此RT-PCR检测方法尤其适用于非常耗时的鲤春病毒的检测鉴定。RT-PCR法检测鲤春病毒的基本步骤包括样本的前处理，在RT-PCR总反应体系中加入缓冲液、氯化镁、Taq酶、逆转录酶、dNTP、模板和引物，设置扩增条件扩增反应。取微量扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，用紫外检测仪观察并用凝胶成像系统照相，观察是否有目的片段出现。PCR方法由于引物设计特异性较强，可以进行种属的鉴别。PCR产物的分析一般采用琼脂糖凝胶电泳分析，初步判断PCR产物片段的大小与预计是否一致。高隆英等人根据鲤春病毒糖蛋白基因序列利用RT-PCR方法检测鲤春病毒，Koutna等人用RT-PCR和套氏PCR相结合的方法，从感染的鱼组织中鉴定出SVCV，Shimahara等人建立了一种经过优化后检测鲤春病毒的RT-PCR技术。但最令人头痛的问题是PCR扩增产物污染，因为PCR产物拷贝量大，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染，在操作时比较剧烈地摇动反应管，尤其是打开反应管的盖进行电泳点样操作时都可形成气溶胶而污染。一个气溶胶颗粒包含大量拷贝，因而由气溶胶造成的污染产生的假阳性是一个值得特别重视的问题。随着分子生物学的发展，逐渐发展了利用荧光定量RT-PCR技术进行SVCV检测手段，如张力峰等人建立了快速检测SVCV的荧光RT-PCR检测技术。