[发明专利]基于焦磷酸测序技术的TIMP3基因启动子区域CPG岛甲基化检测方法

说明书

本发明公开了基于焦磷酸测序技术的TIMP3基因启动子区域CPG岛甲基化检测的方法，以此实现TIMP3基因启动子区域CPG岛甲基化的定量检测。其中所使用的针对该段基因的特异性扩增引物序列如TIMP3‑F和TIMP3‑R所示，针对扩增引物进行焦磷酸测序的测序引物如TIMP3‑S所示。本发明中所示引物及方法将有助于对肿瘤进行早期诊断，对癌症筛查具有重要意义。

技术领域

本发明涉及TIMP3基因启动子区域CPG岛甲基化水平检测。

背景技术

焦磷酸测序技术(pyrosequencing)适用于对已知的短序列进行高通量的、精 确的和重复性好的测序分析，可应用于单核苷酸多态性(single ucleotidepolymor—phism，SNP)、肿瘤甲基化分析等多项研究。该方法在甲基化 水平检测中被誉为“金标准”。其原理为引物与模板DNA退火后，在DNA聚合 酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATPsulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和 三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)4种酶存在的反应体系中，依次加入4种 dNTP(dATPαS、dTTP、dCTP、dGTP)之一，如若发生碱基互补配对，通过多 级反应最终会产生氧化荧光素，发出光信号，从而确定该处碱基。随着该过程循环进行,互补DNA链逐渐合成,DNA序列由Pyrogram的信号峰确定。通过检测 荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。

恶性肿瘤为多因素、多阶段形成，其浸润和转移也涉及穿过细胞外基质屏障、 血管基底膜及穿出血管壁等过程，其中的必要条件为基底膜和细胞外降解。除了 因DNA序列的改变而产生突变，造成肿瘤发生，表遗传学上的改变也会影响肿 瘤的产生。肿瘤组织D NA常常发生其启动子区域的异常甲基化,包括原癌基因 低甲基化和抑癌基因高甲基化改变,一方面激活了癌基因，同时也使抑癌基因失 活。通常启动子区域CpG岛的高甲基化是导致肿瘤发生发展的重要分子生物学 机制。

组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases,TIMPs)家 族共有4个成员，它们按照被发现的顺序依次被命名。其中TIMP3与其他3个 成员不同，它主要定位结合于组织的细胞外基质层中，这也决定了它的作用方向。 TIMP3基因位于人类染色体22q12.1-13.2上，由它编码产生的蛋白质在细胞外合 成后被分泌到细胞内基质中，能拮抗基质金属蛋白酶(matrix me tallopro te inases, MMPs)的活性，这一特异性抑制作用，维持着细胞外基质的降解与合成的平衡， 在抑制肿瘤侵袭转移中起重要作用。TIMP3基因可以抑制肿瘤生长、血管生成， 影响肿瘤的侵袭、浸润和转移,是一种抑癌基因。同时它也是细胞凋亡相关基因， 有促进凋亡的作用。TIMP3表达降低或缺失与肿瘤发生密切相关，其启动子甲 基化也影响多种肿瘤的预后情况，如胃癌、肾癌、胶质瘤、结肠癌、乳腺癌等。 TIMP3基因启动子区域CPG岛的甲基化水平变化存在于多种恶性肿瘤中，其可 能作为肿瘤检测的标志物，有助于肿瘤的早期筛查，为肿瘤治疗提供帮助。

发明内容

本发明中涉及位于人类染色体chr22:32801395-32802281的TIMP3基因，通 过PCR扩增出TIMP3启动子区域CPG岛部分的DNA片段，利用焦磷酸测序技 术检测其每个甲基化位点的甲基化频率，测得的甲基化频率范围为0％-100％， 可做到定量分析，测序结果精确、灵敏度高。

本发明目的在于提供一种检测TIMP3基因启动子区域CPG岛甲基化程度的 试剂盒，涉及基于焦磷酸测序技术检测TIMP3基因启动子区域CPG岛甲基化的 测序引物。包括特异性扩增引物TIMP3-F和TIMP3-R，其中TIMP3-R的5’端添 加生物素标记，以及对扩增出的片段进行焦磷酸测序的测序引物TIMP3-S。引物 序列为：

TIMP3-F：5’-AGTTGGAGTTTGGGGGATTG-3’

TIMP3-R：5’-AACATCTTCCCCTCTCAACT-3’