[发明专利]基于焦磷酸测序技术的TIMP3基因启动子区域CPG岛甲基化检测方法

权利要求书

1.基于焦磷酸测序技术检测TIMP3基因启动子区域CPG岛甲基化的特异性扩增引物TIMP3-F和TIMP3-R，其中TIMP3-R的5’端添加生物素标记；基于焦磷酸测序技术检测TIMP3基因启动子区域CPG岛甲基化的的测序引物TIMP3-S；引物序列为：

TIMP3-F：5’-AGTTGGAGTTTGGGGGATTG-3’

TIMP3-R：5’-AACATCTTCCCCTCTCAACT-3’

TIMP3-S：5’-AGTTTGGGGGATTGG-3’。

2.应用如权利要求1所述引物的方法，其特征在于，扩增的反应条件为：95℃15分钟；94℃30秒，56℃30秒，72℃30秒，47个循环；72℃10分钟。

3.基于焦磷酸测序技术检测TIMP3基因启动子区域CPG岛甲基化的实方法，其特征在于，步骤包括：

一、提取样本中的DNA；

二、将样本DNA中未甲基化的碱基C转化为碱基T，处理方式为将180μl浓度为3M的重亚硫酸钠溶液与含有2μg DNA的20μl水溶液混合置于98℃，10min，然后64℃，2.5个小时；

三、以处理过的DNA为模板，使用扩增引物TIMP3-F和TIMP3-R进行PCR扩增得到所需DNA片段，扩增程序如权利2所示；

四、取6μl PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据产物条带是否肉眼可见并且是否位于200与300bp的标记条带之间来判断扩增是否成功，并根据100bp标记条带之下是否有条带来判断是否有引物二聚体；

五、对于扩增成功且无引物二聚体的样品，将剩余扩增产物进行焦磷酸测序，使用的测序引物为TIMP3-S；

六、依据PyroMark软件输出的报告得到测序序列中每个甲基化位点的甲基化频率。

4.基于焦磷酸测序技术检测TIMP3基因启动子区域CPG岛甲基化水平的试剂盒，涉及的试剂包括250units热启动聚合酶、200μl浓度为10mMdNTPs、2ml缓冲溶液、1.5mldd H₂O、1ml浓度为15mM的MgCl₂、上游扩增引物TIMP3-F、下游扩增引物TIMP3-R和测序引物TIMP3-S。